Izoksazole na bazie trifluorometylowanych flawonoidów jako środki przeciwcukrzycowe i przeciw otyłości: synteza, działanie hamujące amylazę in vitro, dokowanie molekularne i analiza zależności między strukturą a aktywnością

Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.comwiedzieć więcej

Faisal K. Algethami 1,*, Ilyes Saidi 2, Hani Nasser Abdelhamid 3, Mohamed R. Elamin 1, Babiker Y. Abdulkhair 1, Amani Chrouda 4 i Hichem Ben Jannet 2,*

Abstrakcyjny:Cukrzyca jest poważnym problemem zdrowotnym na całym świecie. Zarządzanie trawieniem węglowodanów stanowi alternatywę leczenia.Flawonoidystanowią największą grupępolifenolowezwiązki, wytwarzane przez rośliny powszechnie spożywane jako żywność i/lub wykorzystywane do celów terapeutycznych. Jako takie, izoksazole przyciągnęły uwagę chemików medycznych ze względu na ich znaczną bioaktywność. Dlatego głównym celem tej pracy było odkrycie nowych cząsteczek hybrydowych o właściwościach zarówno flawonoidów, jak i izoksazoli w celu kontrolowania trawienia węglowodanów. Co więcej, grupa trifluorometylowa jest kluczową jednostką w opracowywaniu leków, ze względu na jej silną lipofilność i stabilność metaboliczną. Dlatego niniejsza praca opisuje kondensację uprzednio zsyntetyzowanego trifluorometylowanego flawonolu z różnymi tlenkami arylonitrylu, dając 13 hybrydowych cząsteczek wskazanych jako izoksazole oparte na trifluorometylacji flawonoidów. Struktury otrzymanych związków wydedukowano z analizy 1H NMR, 13C NMR i HRMS. 15 nowo zsyntetyzowanych związków hamowało aktywność -amylazy ze skutecznością w zakresie od 64,5 ± 0,7 procent do 94,7 ± 1,2 procent przy stężeniu 50 µM, przy wartościach IC50 12,6 ± 0,2 µM–27,6 ± 1,1 µM. Najskuteczniejszymi związkami pod względem skuteczności i siły działania były 3b, 3h, 3j i 3m. Wśród nowych trifluorometylacjina bazie flawonoidówizoksazole, związek 3b był najskuteczniejszym inhibitorem aktywności amylazy (PI=94,7 ± 1,2 procent przy 50 µM), o sile (IC50=12,6 ± { {13}},2 µM) podobny do kontroli pozytywnej akarbozy (IC50=12,4 ± 0,1 µM). Badanie zależności struktura-aktywność na podstawie analizy dokowania molekularnego wykazało niską energię wiązania, prawidłowy tryb oddziaływania w kieszeni aktywnej docelowego enzymu oraz zdolność do interakcji z kluczowymi resztami rozszczepienia glikozydowego (GLU{{16). }} i ASP-206), wyjaśniające hamujące działanie -amylazy ustanowionej przez kilka pochodnych.

Słowa kluczowe:- hamowanie amylazy; środek przeciwcukrzycowy; przeciwdziałanie otyłości; cykloaddycja; flawonoidy; izoksazole na bazie flawonoidów z trifluorometylacją; dokowanie molekularne; Analiza SAR

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

1. Wstęp

Otyłośćoraz cukrzyca stanowią główne problemy zdrowotne człowieka na całym świecie [1,2]. Rzeczywiście, cukrzyca charakteryzuje się przede wszystkim niekontrolowanym poziomem cukru we krwi. Jednak cukrzyca typu 1 wynika z zaburzeń wydzielania insuliny (insulinozależnej), podczas gdy typ 2 zwykle wynika z oporności na insulinę (zmiany struktury receptora na komórkach docelowych, prowadzące do zmniejszenia powinowactwa hormonu do receptora), zaburzenia w wydzielaniu insuliny lub obu [3,4]. Nieuchronnie hamowanie degradacji polisacharydów do monosacharydów odpowiednich do wchłaniania do komórek wdraża podstawowe strategie kontroli cukrzycy i pomaga w leczeniu otyłości [3]. Enzym -amylaza (EC.3.2.1.1) jest enzymem trawiennym hydrolizującym -1,4-wiązania glikozydowe węglowodanów, takich jak skrobia [5]. Dlatego hamowanie amylazy przyczynia się w taki czy inny sposób do kontrolowania trawienia węglowodanów [6,7]; w ten sposób stanowi częściowy szlak regulacji aktywności enzymatycznej -amylazy; jest więc idealną terapią w regulacji otyłości i cukrzycy oraz związanych z nimi powikłań [4]. Większość dostępnych na rynku inhibitorów amylazy – takich jak akarboza, miglitol, fazolamina i wogliboza – wiąże się z jelitowymi skutkami ubocznymi, takimi jak wzdęcia, bóle brzucha, biegunka, niewydolność wątroby, ciężkie alergie skórne i torbielowate infekcje jelitowe. ]. Najlepsze inhibitory amylazy to tak zwane inhibitory kompetycyjne, które nieodwracalnie hamują enzym. Inhibitor kompetycyjny wiąże się z miejscem aktywnym docelowego enzymu i w ten sposób zapobiega wiązaniu substratu. Dlatego w hamowaniu kompetycyjnym inhibitor konkuruje z substratem o miejsce aktywne. Z drugiej strony, przy nieodwracalnej inhibicji, inhibitor bardzo powoli dysocjuje od enzymu docelowego, ponieważ został ściśle związany z enzymem. Zazwyczaj nieodwracalne inhibitory wiążą się kowalencyjnie z miejscem aktywnym enzymu przez modyfikację reszt lub grup funkcyjnych niezbędnych do aktywności enzymatycznej, tak że enzym jest nieodwracalnie hamowany. Aby skutecznie hamować trawienie węglowodanów – co może pomóc w kontrolowaniu otyłości, a nawet cukrzycy typu 2 – potrzebujemy nieselektywnej substancji zdolnej do hamowania większości enzymów trawiennych cukrów, a mianowicie amylazy ślinowej, amylazy trzustkowej i glukozydazy [8,9]. Wcześniejsze badania nad półsyntetyzowanymi flawonoidami wykazały, że pochodne flawonoidów na bazie izoksazolu wykazywały znaczące działanie przeciwcukrzycowe poprzez zwiększenie wychwytu glukozy w komórkach HepG2 opornych na insulinę [10]. Ponadto flawonoidy stanowią największą grupę polifenolowych metabolitów wtórnych, które powszechnie występują w roślinach. Te wtórne metabolity są odpowiedzialne za atrakcyjne kolory obserwujących, owoców i liści [11]. Strukturalnie flawonoidy mają szkielet węglowy C15 składający się z dwóch pierścieni aromatycznych (A) i (B), które są połączone ze sobą łańcuchem C3 tworzącym heterocykl (C) [12]. Opisano wiele właściwości biologicznych tego typu związków polifenolowych, takich jak hamowanie amylazy [7,13–15], działanie przeciwcukrzycowe [16,17], przeciwnowotworowe [18,19] iprzeciwutleniaczskutki [20] i inne działania biologiczne [21–25]. Jednak ten bogaty profil biologiczny zmotywował kilka chemicznych zespołów badawczych do syntezy flawonoidów ze specjalnymi ugrupowaniami i podstawnikami w celu ukierunkowania określonych czynności biologicznych [26–30]. Z drugiej strony izoksazol jest pięcioczłonowym heterocyklem o dużym znaczeniu w chemii medycznej. Co więcej, naturalnie występujące izoksazole – takie jak kwas ibotenowy (halucynogenny, neurotoksyna) i muscimol (halucynogenny, antagonista receptora GABAA) [31–34] – przyciągają coraz większą uwagę chemików i farmakologów ze względu na ich silne właściwości biologiczne i farmakologiczne. Ponadto okazuje się, że pochodne izoksazolu mają szerokie spektrum właściwości biologicznych, takich jak działanie przeciwcukrzycowe, przeciwbólowe, przeciwzapalne, przeciw HIV i przeciwnowotworowe [10,35-40]. Pierścień izoksazolowy jest szeroko stosowany jako kluczowy element budulcowy leków takich jak zonisamid (przeciwdrgawkowy) [41], waldekoksyb, parekoksyb (inhibitory COX-2) [42] i leflunomid (przeciwreumatyczny) [43]. W ostatnich dziesięcioleciach na grupę trifluorometylową wzrosło zapotrzebowanie na rozwój związków bioaktywnych, ze względu na jej silny charakter odciągania elektronów, stabilność metaboliczną i charakter lipofilowy, które są uważane za ważne właściwości fizykochemiczne cząsteczek bioaktywnych [44]. Stwierdzono, że ta fluorowana cząsteczka jest niezbędna w wielu ważnych lekach, w tym flufenazynie (przeciwpsychotycznej, przeciwnowotworowej) [45], leflunomidzie (przeciwreumatycznym) [43], celekoksybie (selektywny inhibitor COX-2) [46], fluoksetyna (przeciwdepresyjny) [47] i fluazynam (środek grzybobójczy) [48]. Jeden przegląd literatury wspomina, że ​​trifluorometylowany kwas 5-aminonikotynowy wykazuje obiecującą aktywność -amylazy [49]. Ponadto, chlorowane hybrydowe cząsteczki pirazol–tiazol okazały się dobrymi inhibitorami enzymu -amylazy [50], co również wskazuje na znaczenie atomu chloru w strukturach hamujących -amylazę. Powyższe dane literaturowe opisujące ważne właściwości fizykochemiczne grupy trifluorometylowej – oraz jej udział, obok flawonoidów i izoksazoli w hamowaniu amylazy i wywieraniu działania przeciwcukrzycowego – zachęciły nas do przygotowania nowej serii cząsteczek hybrydowych, w których związane z serią aryloizoksazoli poprzez łącznik metylenowy i do oceny ich siły hamowania enzymu -amylazy. Zależność struktura-aktywność (SAR) została zbadana i zatwierdzona za pomocą analizy dokowania molekularnego.

Cistanche na poprawę odporności

2. Wyniki i dyskusja

2.1. Chemia Otrzymywanie trifluorometylowanego flawonolu (1) – zsyntetyzowanego wcześniej w naszym laboratorium i wykazującego interesujący potencjał cytotoksyczny – zostało opisane zgodnie z procedurą przyjętą przez Znati i in. (2019) [30]. 5-Chloro-2-hydroksyacetofenon skondensowano z 4-(trifluorometylo)benzaldehydem pod chłodnicą zwrotną z metanolem i w obecności wodorotlenku sodu przez 3 godziny w celu wytworzenia 5-chloro{{10 }}(trifluorometylo)-2-hydroksychalkon; następnie pierścień piranowy (C) poddano cyklizacji i węgiel C-3 utleniono przez dodanie (H2O2, NaOH) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (Schemat 1). Cząsteczka 1 została uzyskana z dobrą wydajnością (79%) po wytrąceniu w wodzie z lodem. Schemat 1. Szlak syntezy trifluorometylacji flawonolu (1). Strukturę flawonolu (1) potwierdzono analizą spektroskopową i porównaniem z danymi literaturowymi [30]. Cykladdycja 1,3-dipolarna jest reakcją chemiczną pomiędzy 1,3-dipolem a dipolarofilem, tworzącą pięcioczłonowy pierścień. Stąd 1,3-dipolarna cykloaddycja jest uważana za najważniejszy sposób syntezy szerokiego zakresu izoksazoli. Ponadto regiospecyficzna synteza izoksazoli katalizowana przez Cu(I) pod wpływem promieniowania mikrofalowego opiera się na [3 plus 2] cykloaddycji pomiędzy terminalnymi alkinami (dipolarofilami) i tlenkami arylonitrylu (dipolami), zapewniając wyłącznie 3,5-dipodstawione regioizomery [39,51]. Nasze podejście do trifluorometylacji flawonoidów izoksazoli (3a-m), rozpoczęte od przygotowania dipolarofila (2) poprzez propargilację grupy hydroksylowej w pozycji C -3 flawonolu (1) w bezwodnym DMF dla 2 godziny w temperaturze pokojowej, w obecności K2CO3, jak zilustrowano na Schemacie 2. Dipolarofil (2) otrzymano z doskonałą wydajnością (94%). Schemat 2. Szlak syntezy dipolarofila (2).

Strukturę związku 2 ustalono na podstawie jego danych spektralnych. Rzeczywiście, oprócz sygnałów odpowiadających protonom i węglom wprowadzonym przez flawonol (1), w widmach 1H i 13C NMR wykryto nowe sygnały ugrupowania propargilowego. Ponadto widmo 1H NMR dipolarofila (2), zarejestrowane w CDCl3 przy 300 MHz, wykazało dublet przy δH 5,06 (2H, d, J=2.4 Hz) odpowiadający protonowi metylenu H{{13 }}" i triplet przy δH 2,36 (1H, t, J=2,4 Hz) przypisywany protonowi grupy etynylowej (H-3"). Widmo 13C NMR potwierdziło wprowadzenie grupy propargilowej poprzez obserwację nowych sygnałów w δC 78,4, 76,9 i 59,6, przypisywanych C-2", C-3" i C{{29} }", odpowiednio. Chlorki hydroksymylu a–m są głównymi prekursorami generacji in situ tlenków arylonitrylu — odczynników biorących udział w reakcji 1,3-dipolarnej cykloaddycji do syntezy izoksazoli. Prekursory (a –m) zsyntetyzowano z odpowiednich aldehydów zgodnie z ogólną procedurą opisaną przez Himo i wsp. (2005) [51] Pożądane chlorki hydroksylowe (a–m) otrzymano z dobrymi wydajnościami, wahającymi się od 80 do 98 procent (tab. Tabela 1. Struktury i wydajności chlorków hydroksylowych (a–m) i trifluorometylowania izoksazoli na bazie flawonoidów (3a) -m).

Reakcja 1,3-dipolarnej cykloaddycji została zastosowana w podejściu regiospecyficznym przy użyciu końcowego alkinu (2) i różnych chlorków hydroksylowych (a–m) różnie podstawionych (Schemat 3). Otrzymane wyniki zestawiono w tabeli 1. Schemat 3. Szlak syntezy trifluorometylacji flawonoidów izoksazoli 3a–m. Wszystkie reakcje prowadzono pod promieniowaniem mikrofalowym (250W) w DMF w obecności trietyloaminy i jodku miedziawego (Cul) przez 5 min. Produkty izolowano z mieszaniny reakcyjnej przez proste oczyszczanie na kolumnie z żelem krzemionkowym. Nowo wytworzone 3,{{1{0}}dipodstawione izoksazole (3a-m) otrzymano z wydajnościami w zakresie od 73 do 96 procent (Tabela 1). Struktury zsyntetyzowanych izoksazoli opartych na trifluorometylacji flawonoidów (3a–m) (Tabela 1) określono za pomocą 1H, 13C NMR i DEPT 135. Widma 1H NMR tych związków wykazały rezonans singletowy przy δH 6,3{{68 }}–6,60 przypisywany metynowemu protonowi H-4" pierścienia izoksazolowego, kolejny singlet przy δH 5,35–5,45 przypisywany protonowi metylenowemu H-6" i innym sygnałom w strefa aromatycznego protonu odnosząca się do protonów wprowadzonych przez grupę arylową. Co więcej, te struktury zostały potwierdzone przez ich widma 13C NMR i DEPT 135, pokazujące wszystkie oczekiwane sygnały węgla – zwłaszcza te aromatyczne wprowadzone przez użyte chlorki hydroksylowe, a także węgiel metyny C-4" pierścień izoksazolowy w rezonansie przy δC 1{{9{{1{{105}}0}}}}2,5-103.0 i ten, którego sygnał jest odwrócony w widmie DEPT 135, rezonujący przy δC 63,5–63,9, przypisywany metylenowi C-6”. 2.2. Ocena inhibicji -amylazy Aby kontrolować aktywność enzymu, inhibicja jest jednym z najskuteczniejszych środków terapeutycznych. W związku z tym hamowanie enzymu -amylazy stanowi częściową ścieżkę kontrolowania cukrzycy i kontrolowania wagi poprzez hamowanie trawienia węglowodanów. Do tej pory leki takie jak akarboza stanowiły część arsenału leków stosowanych w leczeniu cukrzycy i otyłości. Jednak akarboza nie jest stosowana w monoterapii, ze względu na jej skuteczność i skutki uboczne; zamiast tego akarboza jest stosowana jako terapia dodatkowa i jest bardzo często stosowana w połączeniu z innymi lekami hipoglikemicznymi. Wraz z tym lek ten jest powszechnie stosowany jako standardowy związek w badaniach hamowania -amylazy. W tym badaniu 15 zsyntetyzowanych związków (1, 2 i 3a–m) oceniono pod kątem ich aktywności hamującej wobec amylazy. Wyniki wyrażono w parametrach siły (IC50 ± SEM µM) i skuteczności (PI przy 5{0 µM) i podano w Tabeli 2. Zgodnie z wynikami, zsyntetyzowane cząsteczki (1, 2 i 3a–m) posiadały nieznaczną aktywność anty- -amylazy (p mniejsze lub równe 0.05), ze skutecznością w zakresie od 64,5 ± {{177} } 0,7 do 94,7 ± 1,2 procent przy stężeniu 50 µM, a moce wartości IC5{{2{{2{07}}2}} różnią się od 12,6 ± {{219} }.2 do 27,6 ± 1,1 µM. Spośród nowo przygotowanych izoksazoli opartych na flawonoidzie trifluorometylacyjnym, 3b (R1 =F, R2 =H) okazał się być najsilniejszy (IC50=12,6 ± 0,2 µM) i najskuteczniejszy (PI=94,7 ± 1,2 procent przy 50 µM) związek do hamowania aktywności enzymu -amylazy. Stwierdzono, że te znaczące wartości są porównywalne z wartościami akarbozy (PI=97,8 ± 0,5 procent przy 50 µM; IC{50=12,4 ± 0,1 µM), stosowanej jako substancja standardowa. Podobnie, związki 3h, 3j i 3m można uznać za bioaktywne pod względem skuteczności i siły działania (PI= 93,1 ± 0,9 procent –93,5 ± 1,1 procent przy 50 µM; IC50=13.3 ± 0,2 µM–13,8 ± 0,1 µM) w porównaniu z ich analogiem 3b i akarbozą. Stwierdzono również, że pozostałe związki (1, 2, 3a, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 3i, 3k i 3l) są zdolne do hamowania enzymu -amylazy, ale pozostają mniej skuteczne (PI{{ 140}},5 ± 0,7 procent -87,1 ± 0,7 procent przy 50 µM; IC50=14,4 ± 0,2 µM do 27,6 ± 1,1 µM) niż wyżej wymienione analogi. Aktywność anty- -amylazy osiągnięta przez zsyntetyzowane związki jest zgodna z poprzednimi doniesieniami, wśród których Nie i in. (2020) [10] donoszą, że izoksazole na bazie flawonoidów mogą stanowić cenne rusztowania do odkrywania leków przeciwcukrzycowych. Porównując struktury i aktywności zsyntetyzowanych cząsteczek, związki 3bd, halogenowane w pozycji para grupy fenylowej przyłączonej do pierścienia izoksazolowego, wykazały znaczną skuteczność (PI= 85.4 ± 0,9% –94,7 ±1,2% przy 50 µM) i siła (IC50=12,6 ± 0,2 µM–14,6 ± 0,3 µM) w hamowaniu enzymu -amylazy. To odkrycie jest zgodne z literaturą, pokazując, że obecność atomów halogenu (F, Cl lub Br) w strukturze była niezbędna do silnego hamowania amylazy [49,50]. Ponadto badanie zależności struktura-aktywność pozwoliło nam stwierdzić, że bardziej indukcyjny atraktor (-I) i mezomeryczny donor (plus M) zwiększają skuteczność i siłę hamowania amylazy (aktywność fluorowanej pochodnej 3b (R{{186}) } F, R2=H; PI=94,7 ± 1,2 procent przy 50 µM; IC50=12,6 ± 0,2 µM) jest wyższe niż w przypadku chlorowanej pochodnej 3c (R{ {198}} Cl, R2=H; PI=87,1 ± 0,7 procent przy 50 µM; IC50=14,4 ± 0,2 µM), a następnie bromowana pochodna 3d (R 1=Br, R2=H; PI=85,4 ± 0,9 procent przy 50 µM; IC50=14,6 ± 0,3 µM)), zgodnie z poprzednimi badaniami [ 4,49]. Oczywiste jest, że hamowanie -amylazy wzrasta wraz z efektami indukcyjnego atraktora (-I) i mezomerycznego donora (plus M) atomów halogenu.

2.3. Badania dokowania molekularnegoEnzym -amylaza (EC 3.2.1.1) – hydrolaza glikozylowa – hydrolizuje wiązania -1,4-glikozydowe w skrobiach, takich jak amyloza. Struktura krystaliczna enzymu -amylazy (PDB: 7TAA) składa się z łańcucha A o długości sekwencji 478 aminokwasów [52]. -Amylaza jest jednym z najważniejszych kluczowych enzymów odpowiedzialnych za trawienie węglowodanów [5]; w ten sposób blokowanie enzymu -amylazy oferuje strategię kontrolowania cukrzycy i pomaga w leczeniu otyłości [6,7]. Przeprowadzono szeroko zakrojoną analizę dokowania molekularnego w celu zbadania trybu wiązania, określenia prawdopodobnych oddziaływań zsyntetyzowanych cząsteczek (1, 2 i 3a–m) w hydrofobowej kieszeni wiążącej ABC (zmodyfikowany heksasacharyd akarbozy) struktury krystalicznej białka Aspergillus oryzae - enzym amylazy (PDB: 7TAA) [52] przy użyciu oprogramowania AutoDock Vina i zracjonalizować obserwowaną in vitro aktywność nowo zsyntetyzowanych związków hamującą amylazę. Wszystkie zsyntetyzowane cząsteczki (1, 2 i 3a–m) – oraz akarboza, stosowana jako standardowa substancja – były badane in silico. Energie wiązania i szczegóły oddziaływań (liczba oddziaływań, liczba oddziałujących aminokwasów, oddziałujących aminokwasów i wiązań wodorowych) ligandów z docelowym enzymem przedstawiono w Tabeli 2. Na podstawie wyników dokowania in silico (Tabela 2) zaobserwowano że związki 1 i 2 wykazywały dobre energie wiązania (odpowiednio -7,7 i -7,8 kcal/mol) w miejscu wiązania enzymu -amylazy (PDB: 7TAA). Wartości te są porównywalne z wartościami substancji standardowej (akarboza, -7,9 kcal/mol), co pozwala na ich korzystne dopasowanie do miejsca aktywnego docelowego enzymu. Co ciekawe, nowo zsyntetyzowane izoksazole na bazie flawonoidów trifluorometylujących (3a–m) dały oczekiwane rezultaty; były one prawidłowo w pozycji wiążącej i wykazywały wspaniałe energie wiązania w zakresie od -9,6 do -8,2 kcal/mol (Tabela 2). To pozwoliłoby im wszystkim lepiej dopasować się do miejsca aktywnego enzymu -amylazy, lepiej niż akarboza. Sposób wiązania trzech najbardziej aktywnych związków (3b, 3h i 3j) z docelowym enzymem omówiono poniżej. Związek 3b — najsilniejszy i najskuteczniejszy inhibitor enzymu -amylazy w testowanej serii izoksazoli opartych na trifluorometylacji flawonoidów — wykazywał doskonałą energię wiązania -9,6 kcal/mol. Ponadto tryb wiązania 3b sugeruje, że jest on zaangażowany w 16 niekowalencyjnych oddziaływaniach z 10 aminokwasami (Tabela 2). Dokładnie, ugrupowanie 3-(3-(4-fluorofenylo)izoksazol-5-ylo)metoksyl tworzy dwa wiązania halogenowe (fluor) z ASP-206, Pi –Pi wiązanie w kształcie litery T z TYR-82, wiązanie kationowe Pi z HIS-80, cząsteczki 2021, 26, 5214 8 z 18 dwóch konwencjonalnych wiązań wodorowych z ARG{{71 }} oraz anion Pi i wiązanie węgiel-wodór z resztą ASP-340. Ponadto grupa trifluorometylowa przyłączona do C-40 szkieletu flawonoidowego bierze udział w konwencjonalnym wiązaniu wodoru z GLY-167 i dwoma wiązaniami alkilowymi z grupą aminową LEU-166 i LEU-173 kwasy. Z drugiej strony, szkielet flflawonoidowy oddziałuje poprzez wiązanie anionowe Pi z ASP-340, konwencjonalne wiązanie wodorowe z GLN-35 oraz wiązanie piętrowe Pi-alkilowe i dwa Pi-Pi z TYR{ {80}} (rysunek 1).

Figura 1. Związek 3b pasuje do hydrofobowej kieszeni wiążącej ABC w PDB: 7TAA.

Ponadto związek 3h wykazywał interesującą energię wiązania -9,3 kcal/mol. Jego tryb wiązania pokazuje, że bierze udział w 15 niekowalencyjnych oddziaływaniach z 10 resztami (Tabela 2). W związku z tym, wgląd molekularny z analizy dokowania sugeruje, że ugrupowanie 3-(3-(4-metoksyfenylo)izoksazol-5-ilo)metoksyl tworzy dwa wiązania węgiel-wodór z GLU{{12 }}, wiązanie w kształcie litery T Pi-Pi z TYR-82, dwa konwencjonalne wiązania wodorowe z ARG-344, wiązanie węgiel-wodór z HIS-80 i wiązanie anionowe Pi z resztą ASP-340. Ponadto grupa trifluorometylowa bierze udział w konwencjonalnym wiązaniu wodorowym z GLY-167 oraz w dwóch oddziaływaniach alkilowych z aminokwasami LEU-166 i LEU-173. Ponadto szkielet flflawonoidowy jest zaangażowany w konwencjonalne wiązanie wodorowe z GLN-35, wiązanie anionowe Pi z ASP-340, dwa ułożone wiązania Pi-Pi oraz wiązanie Pi-alkilowe z TYR{ {24}} (Rysunek 2)

Z drugiej strony, związek 3j wykazywał znaczną energię wiązania -9,2 kcal/mol. Jego tryb wiązania pokazuje, że bierze udział w 16 niekowalencyjnych oddziaływaniach z 13 aminokwasami (Tabela 2). Dlatego dogłębna analiza dokowania molekularnego sugeruje, że 3-(3-(4-butoksy-3-chlorofenylo)izoksazol-5-ylo)metoksyl tworzy dwa konwencjonalne wiązania wodorowe z ARG-344, trzy wiązania Pi-alkilowe z TYR-82, HIS-210 i HIS-296, oddziaływanie alkilowe z LEU-232, wiązanie węgiel-wodór z resztą GLU-230, wiązanie anionowe Pi z ASP-340 i wiązanie kationowe Pi z HIS-80. Dodatkowo, grupa trifluorometylowa połączona z aromatycznym pierścieniem B szkieletu flflawonoidowego jest zaangażowana w konwencjonalne wiązanie wodorowe z GLY-167 i dwoma oddziaływaniami alkilowymi z resztami LEU-166 i LEU-173. Ponadto szkielet flflawonoidowy jest zaangażowany w konwencjonalne wiązanie wodorowe z GLN-35 oraz wiązaniem Pi–alkilowym i dwoma wiązaniami Pi–Pi z aminokwasem TYR-75 (Rysunek 3). W enzymie amylazy Aspergillus oryzae (PDB: 7TAA) nukleofil i reszty katalityczne kwasowo-zasadowe, które są odpowiedzialne za rozszczepianie wiązań glikozydowych, to aminokwasy ASP-206 i GLU-230 , odpowiednio [5]. Dlatego interakcje między białkiem a ligandem, głównie poprzez reszty GLU-230 i ASP-206, są najlepszym sposobem blokowania rozszczepiania wiązań glikozydowych. W rzeczywistości niska energia wiązania, prawidłowa pozycja wiązania, zdolność do interakcji z kluczowymi resztami rozszczepienia glikozydowego (GLU-230 i ASP-206) oraz duża liczba interakcji w aktywnej kieszeni docelowy enzym (Tabela 2) może wyjaśniać silną skuteczność hamującą -amylazy ustaloną przez większość związków.

Rysunek 3. Związek 3j pasuje do hydrofobowej kieszeni wiążącej ABC w PDB: 7TAA

3. Materiały i metody

3.1. Ogólne eksperymentalneProcedury Wszystkie użyte rozpuszczalniki były świeżo destylowane przed użyciem. Wszystkie reakcje chemiczne monitorowano przy użyciu komercyjnych płytek TLC (żel krzemionkowy 60, F254, SDS). Do określenia temperatur topnienia zastosowano aparat Buchi 510. Wszystkie widma 1H NMR (300 MHz), DEPT 135 i 13C NMR (75 MHz) rejestrowano w deuterowanym chloroformie i dimetylosulfotlenku-d6 za pomocą spektrometru Bruker AC-300. Wszystkie przesunięcia chemiczne (δ) podano w częściach na milion (ppm), stałe sprzężenia (J) podano w hercach (Hz), a rezonans resztkowego niedeuterowanego rozpuszczalnika zastosowano jako wewnętrzne odniesienie. Widma DCI-HRMS wykonano w aWaters GCT 1er w trybie jonów dodatnich. Widma ESI-HRMS rejestrowano za pomocą ESI-TOF (Waters LCT, Markham, Ontario, Kanada) w trybie jonów dodatnich przy użyciu trybu reflektronu.

4. Wnioski

Nowo zsyntetyzowane izoksazole na bazie flawonoidów (3a–m) na bazie trifluorometylacji zostały ocenione in vitro pod kątem ich aktywności hamującej -amylazę i odnotowano znaczące wyniki. Cykloaddukty 3b, 3h, 3j i 3m wykazywały porównywalną skuteczność i siłę działania do akarbozy stosowanej jako substancja standardowa do hamowania enzymu -amylazy. Ponadto analiza zależności struktura-aktywność wykazała, że ​​najbardziej aktywnymi związkami są pochodne chlorowcowane i alkoksylowane. Zgodnie z analizą silicodocking, izoksazole oparte na trifluorometylacji flawonoidów wykazały niską energię wiązania, dużą liczbę interakcji i prawidłową pozycję wiązania w aktywnej kieszeni docelowego enzymu. Większość z nich oddziaływała z nukleofilem i katalitycznymi resztami kwasowo-zasadowymi (GLU-230 i ASP-206), co może wyjaśniać ich skuteczność i siłę hamowania aktywności enzymatycznej -amylazy. Obiecujące działania, jakie wykazują zsyntetyzowane związki hybrydowe, zachęcają do ich zaangażowania jako kandydatów do odkrycia nowych środków przeciwcukrzycowych i przeciw otyłości. Jednak bardzo szczegółowe badania i czynniki bezpieczeństwa muszą uwzględniać ryzyko związane z nowością substancji czynnej, toksycznością, stabilnością i rozpuszczalnością w środowisku wodnym oraz właściwościami farmakodynamicznymi, w tym niezawodnością, z jaką można monitorować skutki uboczne u ludzi przed wystąpieniem potencjalnie poważnych/nieodwracalnych skutków. Materiały uzupełniające: Poniższe są dostępne online, Widma NMR zsyntetyzowanych związków (1, 2 i 3a–m), Tabela S1: Krzywe stężenie-odpowiedź użyte do obliczenia wartości IC50. Wkład autorów: Konceptualizacja FKA i IS; metodologia, HBJ; oprogramowanie, IS i H.NA; walidacja, FKA i AC; analiza formalna, MRE; dochodzenie, FKA i IS; zasoby, BYA; kuratorstwo danych, FKA i IS; pisanie – przygotowanie oryginalnego projektu, FKA i IS; pisanie – recenzja i redakcja, HBJ; wizualizacja, FKA i BYA; nadzór, HBJ; administracja projektu, FKA i HBJ; pozyskanie finansowania, FKA Wszyscy autorzy przeczytali i wyrazili zgodę na opublikowaną wersję manuskryptu. Finansowanie: Niniejsze badanie nie otrzymało zewnętrznego finansowania. Uniwersytet za finansowanie tej pracy przez Grupę Badawczą. RG-21-09-69.Konflikt interesów: Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.Dostępność próbek: Próbki związków nie są dostępne u autorów.

Bibliografia
1. Boutayeb, A.; Boutayeb, S. Obciążenie chorobami niezakaźnymi w krajach rozwijających się. wewn. J. Equity Health 2005, 4, 1–8. [Odn.]
2. Wagnera, KH; Brath, H. Globalne spojrzenie na rozwój chorób niezakaźnych. Poprzedni. Med. 2012, 54, S38–S41. [Odn.]
3. Tseng, CH Potencjalne mechanizmy biologiczne cukrzycy wywołanej arsenem. Toksykol. Zał. Pharmacol. 2004, 197, 67-83. [Odn.]
4. Sala, D.; Zorzano, A. Różnicowa kontrola masy mięśniowej w cukrzycy typu 1 i typu 2. Komórka. Mol. Życie Sci. 2015, 72, 3803–3817. [Odn.]
5. Brzozowski AM; Davies, GJ Struktura amylazy aspergillus oryzae skompleksowanej z inhibitorem akarbozą przy rozdzielczości 2 0 Å. Biochemia 1997, 36, 10837-10845. [Odn.]
6. Jayaraj, S.; Suresh, S.; Kadeppagari, inhibitory amylazy RK i ich zastosowania biomedyczne. Starch-Stärke 2013, 65, 535-542. [Odn.]
7. Khan, S.; Nazir, M.; Raiz, N.; Saleem, M.; Zengin, G.; Fazal, G.; Saleem, H.; Muchtar, M.; Tousif, MI; Tareen, RB; i in. Profilowanie fitochemiczne, właściwości biologiczne in vitro oraz badania in silico nad stadami Caragana ambigua (Fabaceae): kompleksowe podejście. Ind. Uprawy Prod. 2019, 131, 117–124. [Odn.]
8. Berg, JM; Tymoczko, JL; Stryer, L. Enzymy mogą być hamowane przez określone cząsteczki. W Biochemii, wyd. 5; WH Freeman: Nowy Jork, NY, USA, 2002.
9. Kam, A.; Li, KM; Razmowski-Naumowski, V.; Nammi S.; Shi, J.; Chan, K.; Li, GQ Badanie porównawcze nad hamującym wpływem różnych części i składników chemicznych granatu na -amylazę i -glukozydazę. Fitoter. Res. 2013, 27, 1614-1620. [Odn.]
10. Nie, JP; Qu, ZN; Chen, Y.; Chen, JH; Jiang, Y.; Jin, Minnesota; Yu, Y.; Niu, WY; Duan, siedziba; Qin, N. Odkrycie i działanie przeciwcukrzycowe nowych pochodnych flawonoidów na bazie izoksazolu. Fitoterapia 2020, 142, 104499. [Odsyłacz]
11. Malešev, D.; Kunti´c, V. Badanie chelatów metal-flawonoidy i oznaczanie flawonoidów poprzez reakcje kompleksowania metal-flawonoidy. J. Serb. Chem. Soc. 2007, 72, 921-939. [Odn.]
12. Pinheiro, PF; Goncalon, CJ Analiza strukturalna flawonoidów i związków pokrewnych — przegląd zastosowań spektroskopowych. W fitochemikaliach — globalna perspektywa ich roli w odżywianiu i zdrowiu; InTech: Londyn, Wielka Brytania, 2012.
13. Lo Piparo, E.; Scheib, H.; Frei, N.; Williamson, G.; Grigorow, M.; Chou, CJFlawonoidy dlakontrolowanie trawienia skrobi: Wymagania strukturalne dla hamowania ludzkiej amylazy. J. Med. Chem. 2008, 51, 3555-3561. [Odn.]
14. Xiao, J.; Ni, X.; Kai, G.; Chen, X. Przegląd relacji struktura-aktywność dietyhamujące polifenole-amylasa. Kryt. Ks. Nutr. 2013, 53, 497–506. [Odsyłacz] [PubMed]
15. Hua, F.; Zhou, P.; Wu, HY; Chu, GX; Xie, ZW; Bao, GH Hamowanie -glukozydazy i -amylazy przez glikozydy flawonoidowe z herbaty Lu'an GuaPian: mechanizm dokowania molekularnego i interakcji. Funkcja żywności. 2018, 9, 4173–4183. [Odsyłacz] [PubMed]
16. Vinayagam, R.; Xu, B. Właściwości przeciwcukrzycowe flawonoidów dietetycznych: przegląd mechanizmu komórkowego. Nutr. Metab. 2015, 12, 1–20. [CrossRef] [PubMed] 17. Ghorbani, A. Mechanizmy działania przeciwcukrzycowego flawonoidów rutyny. Biomed. Farmakotera. 2017, 96, 305–312. [Odsyłacz] [PubMed]