Wspomagana ultradźwiękami ekstrakcja kwasów fenolowych, flawonoli i flawanoli-3-oli ze skórek i nasion winogron muskadynowych przy użyciu naturalnych głębokich rozpuszczalników eutektycznych i modelowania predykcyjnego za pomocą sztucznych sieci neuronowych

Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.compo więcej informacji

AbstrakcyjnyCelem tego badania było zbadanie skuteczności ekstrakcji 9 naturalnych głęboko eutektycznych rozpuszczalników (NDES) za pomocą ultradźwięków dlakwasy fenolowe, flawonole, a także flawan-3-ole w skórkach i nasionach winogron muscadine (Carlos) w porównaniu z 75-procentowym etanolem. Zastosowano sztuczną sieć neuronową (ANN), aby zoptymalizować zawartość wody NDES, czas ultradźwięków, stosunek substancji stałych do rozpuszczalnika oraz temperaturę ekstrakcji, aby osiągnąć najwyższą wydajność ekstrakcji dla kwasu elagowego, katechiny i epikatechiny. Nowo sformułowany NDES (#1) składa się z chlorku choliny:kwas lewulinowy: glikol etylenowy 1:1:2 i 20 procent wody wyekstrahowały największą ilość kwasu elagowego w skórze przy 22,1 mg/g. Ta wydajność była 1.73-krotnie większa niż przy 75% etanolu. Zmodyfikowany NDES (#3) składający się z chlorku choliny:proliny:kwasu jabłkowego 1:1:1 i 30% wody wyekstrahował największą ilość katechiny (0.61 mg/g) i epikatechiny (0,89 mg/g) w skórze i odpowiednio 2,77 mg/g i 0,37 mg/g w nasionach. Optymalna wydajność kwasu elagowego w skórze przy zastosowaniu NDES #1 wynosiła 25,3 mg/g (obserwowane) i 25,3 mg/g (przewidywane). Optymalna wydajność (katechiny plus epikatechina) w nasionach przy użyciu NDES #3 wynosiła 9,8 mg/g (obserwowane) i 9,6 mg/g (przewidywane). Badanie to wykazało wysoką wydajność ekstrakcji wybranych NDES dla polifenoli w zoptymalizowanych warunkach.

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

Wstęp

Naturalne głębokie rozpuszczalniki eutektyczne (NDES) wytwarza się przez zmieszanie donorów wiązań wodorowych z akceptorami wiązań wodorowych w odpowiednim stosunku molowym [1]. Temperatura topnienia jednego składnika powinna być niższa niż temperatura topnienia drugiego [1]. Po podgrzaniu i wymieszaniu to medium staje się płynne w temperaturze pokojowej. W celu stabilizacji i polaryzacji mieszaniny dodaje się wodę. Badania w dziedzinie ekstrakcji fitochemicznej przy użyciu NDES rozszerzyły się ze względu na ich efektywną ekstrakcję i rozpuszczalność. Niemniej jednak wiele czynników odgrywa znaczącą rolę przy porównywaniu NDES z rozpuszczalnikami organicznymi, w tym wydajność, koszt, odzysk i toksyczność. Wcześniejsze badania dotyczyły NDES ekstrakcji różnych polifenoli z różnych matryc żywności. Na przykład Bubalo i in. (2016) porównali 5 NDES, wodę, 70% metanol (v/v) i zakwaszony 70% metanol (v/v), aby wyekstrahować antocyjany, katechinę i kwercetynę-3-O-glukozyd ze skórek czerwonych winogron. Stwierdzono, że NDES składający się z chlorku choliny: kwasu szczawiowego (1:1) z 25% zawartością wody (v/v) jest najbardziej wydajnym rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym [2]. W innym badaniu Panic et al. (2019) przetestowali 8 NDES i zakwasili 70 procent etanolu i zaobserwowali chlorek choliny: kwas cytrynowy (2:1) z 30 procentami wody (v/v) jako najlepszy NDES do ekstrakcji antocyjanów z wytłoków winogron [3]. Winogrona muscadine (Vitis rotundifolia) pochodzą z południowo-wschodnich stanów i są pierwszymi uprawnymi dzikimi winogronami w Stanach Zjednoczonych [4]. Winogrona Muscadine są produkowane w 12 stanach i łącznie około 5000 akrów [5]. Istnieje 100 odmian winorośli muscadine, a każda z nich różni się właściwościami fizycznymi, sensorycznymi lub chemicznymi [4]. Wśród nich Carlos jest szeroko uprawianym winogronem muskadynowym ze względu na wysokie plony i konsystencję wzrostu [4]. Winogrono Carlos muscadine jest średniej wielkości, koloru brązowego, grubsze w skórce i zawiera średnio cztery nasiona [6]. Winogrona Muscadine zawierają znaczne ilościpolifenoleo których wiadomo, że zmniejszają stan zapalny [7], hamują wzrost guza prostaty [8] i poprawiają reakcje metaboliczne diabetyków [9]. Wytłoki z winogron muskadynowych, produkt uboczny wyciskania soku z winogron muskadynowych lub produkcji wina, składają się ze skórek i nasion. W poprzednim badaniu wykorzystano mieszaninę aceton:woda:kwas octowy (70:29,7:0,3, v/v) do ekstrakcji związków fenolowych z nasion, skórki i miąższu ośmiu odmian winogron muscadine uprawianych na Florydzie, w tym Carlosa [10]. Jednak zastosowanie palnych rozpuszczalników organicznych i ich niska wydajność ekstrakcji utrudniały praktyczne zastosowania. Większość wytłoków z winogron muskadynowych jest nadal wyrzucana jako odpad. Sztuczne sieci neuronowe (SSN) to nieliniowy system mapowania składający się z różnych podstawowych jednostek przetwarzania połączonych asocjacjami ważonymi. Te jednostki przetwarzania nazywane są „neuronami” [11]. Sztuczne sieci neuronowe to podejście do uczenia maszynowego służące do przewidywania lub prognozowania odpowiedzi na podstawie wielu danych wejściowych [11]. Wcześniejsze badania wykorzystywały metody powierzchni odpowiedzi (RSM) do optymalizacji i przewidywania ekstrakcji. Jednak w niewielu badaniach wykorzystano ANN w tym samym celu. Na przykład Sinha i in. (2013) zasugerowali, że ANN ma lepszą wydajność predykcyjną niż RSM w zakresie ekstrakcji naturalnego barwnika z nasion Bixa Orellana (Annatto) [12]. W podobnym badaniu Ciric i in. (2020) stwierdzili, że model ANN był lepszy niż RSM w przewidywaniu ekstrakcji związku fenolowego z czosnku [13]. Celem tych badań było zbadanie wydajności ekstrakcji 9 NDES dla kwasów fenolowych, flawonoli i flawanoli-3-oli w porównaniu z 75% etanolem za pomocą ultradźwięków. ANN zastosowano do przewidywania i optymalizacji warunków ekstrakcji na wydajność fenolu. Hipoteza była taka, że ​​NDES o określonych składach ekstrahuje większe ilości kwasów fenolowych, flawonoli i flawanoli-3-oli niż 75% etanolu, a najwyższą wydajność ekstrakcji można osiągnąć dzięki modelowaniu predykcyjnemu opartemu na ANN.

2. Materiały i metody 2.1. Chemikalia i odczynniki Chlorek choliny, kwas lewulinowy, 1,2-propanodiol, kwas DL-jabłkowy, kwas szczawiowy, kwas solny i kwas mrówkowy otrzymano z Acros Organics (Morris Plains, NJ, USA). Kwas mlekowy, glikol etylenowy, glicynę, acetonitryl o czystości do HPLC, metanol i etanol zakupiono z Fishers Scientific (Waltham, Massachusetts, USA). L-prolinę i chlorowodorek betainy zakupiono w firmie Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA). Wzorce klasy HPLC dla kwasu elagowego, kwasu galusowego, kwasu ferulowego, (plus)-katechiny, (-)-epikatechiny, mirycetyny, kwercetyny i kempferolu uzyskano od Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA).

2.2. Projekt NDESNDES nr 1–2 w tabeli 1 zostały zaprojektowane w naszym poprzednim badaniu [14]. Chlorek choliny w NDES #1–2 został wybrany jako akceptor wodoru, podczas gdy dla każdego nowego NDES wybrano dwa różne donory wodoru. We wstępnych eksperymentach określono stosunki molowe między donorami i akceptorami wodoru oraz zawartość wody. NDES #3–9 w Tabeli 1 zostały wybrane z literatury, ponieważ wcześniejsze badania wskazały je jako skuteczne NDES w ekstrakcji polifenoli. Zawartość wody w NDES #3 została zmodyfikowana na podstawie cytowanej literatury. Do przygotowania NDES zastosowano metodę ogrzewania [15]. W skrócie, akceptor wiązania wodorowego zmieszano z każdym ze składników będących donorami wiązania wodorowego w kolbach Erlenmeyera za pomocą mieszadła. Mieszaninę w kolbie zamknięto i ogrzewano w 50◦C przez około 30 min lub aż utworzyła się klarowna ciecz i pozostała stabilna w temperaturze pokojowej. Zawartość wody w tabeli 1 obliczono według końcowej objętości mieszanin NDES. pH NDES wymienione w Tabeli 1 mierzono za pomocą pehametru (AB15, Accumet, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). 2.3. Przygotowanie próbki / Ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami Mrożone skórki i nasiona winogron muscadine (Vitis rotundifolia) (odmiana: Carlos) zostały dostarczone przez Paulk Vineyards (Wray, Georgia, USA). Po usunięciu łusek, liści lub ogonków, wytłoki rozdzielano na nasiona i skórkę. Próbki następnie suszono w piecu próżniowym (Isotemp, Model 285A, Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) w 60◦C i pod ciśnieniem niższym niż −30 cali Hg. Następnie próbki homogenizowano na drobny proszek przy użyciu młynka chimerycznego (A1{{105}}00, RRH Inc., 2800 W, Zhejiang, Chiny). Stosując początkowy stosunek substancji stałej do rozpuszczalnika 1:20 (g: mL), 0,50 g skórki winogron muskadynowych lub nasion zmieszano w 10 mL NDES lub 75% etanolu w trzech powtórzeniach. Próbki umieszczono następnie w łaźni wodnej (60 ◦C) i poddano działaniu ultradźwięków (VCX 1500, Sonics & Materials Inc., 1500-Watt, 50/60 Hz, Newtown, CT, USA) na 30 min przy 100% amplituda dla dwóch rund (15 min/rundę). Następnie próbki natychmiast odwirowano (Sorvall ST 8, Fisher Scientific, Suzhou, Chiny) przy 3260 g aż do uzyskania przejrzystego supernatantu. Na koniec supernatanty zebrano i przechowywano w zamrażarce o temperaturze − 20◦C do analizy HPLC kwasów fenolowych (kwas elagowy, kwas galusowy, kwas ferulowy), flawonoli (mirycetyna, kwercetyna i kaempferol) oraz flawano-3-oli (katechina i epikatechina). 2.4. Analizy HPLC kwasów fenolowych, flawonoli i flawo-3-oli Kwasy fenolowe, flawonole i flawanole-3-ole analizowano w systemie HPLC (Agilent Technologies 1200, Waldbronn, Niemcy) zgodnie z metodą opisaną w Sandhu i Gu (2013) [16]. System HPLC składa się z pompy binarnej, autosamplera, termostatowanego przedziału kolumny, detektora diodowego i detektora fluorescencyjnego. Ekstrakty ze skórek lub pestek winogron hydrolizowano przed analizami kwasów fenolowych i flawonoli. Hydrolizę przeprowadzono przez zmieszanie 1 ml ekstraktu z 4 ml roztworu do hydrolizy (1,2 M HCl zawierający 50% metanolu) i umieszczenie w łaźni wodnej (Precision, Model 2837, 400 W, 50/60 Hz, Thermo Scientific, Marietta , OH, USA) w 90°C przez 80 min. Następnie próbki schłodzono do 25◦C, po czym poddano działaniu ultradźwięków przez 5 min. Hydroliza ekstraktu nie była potrzebna do analizy katechiny i epikatechiny. Zhydrolizowane i niezhydrolizowane ekstrakty przesączono przez membranę 0,45 μm politetrafluoroetylenu (PTFE) przed analizami HPLC. W celu analizy kwasu elagowego, kwasu galusowego, kwasu ferulowego, mirycetyny, kwercetyny, kemferolu, katechiny i epikatechiny, 10 µl wstrzyknięto do kolumny SB-C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm, Zorbax, Agilent, Santa Clara, CA, USA). Fazami ruchomymi były (A) 0,5% kwas mrówkowy i (B) 100% acetonitryl. Szybkość przepływu wynosiła 1 ml/min przy 25 min zmodyfikowanym gradiencie w następujący sposób: 0–5 min, 10–30 procent B; 5-10 min, 30-40% B; 10-20 min, 40-50% B; 20-25 min, 50-10% B; a następnie 5 min równoważenia. Temperaturę kolumny ustawiono na 30◦C. Długość fali detekcji wynosiła 260 nm dla kwasu elagowego, kwasu galusowego i kwasu ferulowego oraz 360 nm dla mirycetyny, kwercetyny i kaempferolu na detektorze z matrycą fotodiodową. Wzbudzenie i emisja dla katechiny i epikatechiny wynosiły odpowiednio 230 nm, 321 nm przy użyciu detektora fluorescencyjnego. Związki polifenoli oznaczono ilościowo przy użyciu standardowych krzywych kwasu elagowego, kwasu galusowego, kwasu ferulowego, mirycetyny, kwercetyny, kaempferolu, katechiny i epikatechiny. Wszystkie krzywe standardowe miały 7 punktów i R2 > 0,99. 2.5. Indywidualny projekt dla sztucznych sieci neuronowych Cztery niezależne zmienne ekstrakcji na czterech poziomach: zawartość wody (15–60 procent), czas ultradźwięków (5–35 min), stosunek substancji stałej do rozpuszczalnika (1:5–1:20) i ekstrakcja temperatury (30–60 ◦C) (tabela S1) w celu optymalizacji wydajności ekstrakcji fenolokwasów, flawonoli i flawanoli-3-oli. W przeciwieństwie do klasycznych projektów, takich jak projekt powierzchni odpowiedzi, projekt oparty na SSN nie wymaga powtarzania przebiegów i preferuje inną strukturę danych. W naszym poprzednim badaniu [14] ANN była bardziej wiarygodną metodą przewidywania wydajności ekstrakcji niż RSM. Dlatego w tym badaniu wybrano ANN, aby przewidzieć wydajność ekstrakcji kwasu elagowego, katechiny i epikatechiny. Niestandardowy projekt z 40 przebiegami (tabela S2) został wygenerowany w JMP Pro (wersja 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) w celu dostarczenia danych specjalnie do modelowania predykcyjnego ANN. Zastosowano randomizację 40 przebiegów w celu wyeliminowania błędu systematycznego. Główne równanie SSN jest pokazane następująco:=∑jj=1 wh jpg plus bhk, k=1toK (1) gdzie h jest liczbą neuronów w warstwie ukrytej, j i k to odpowiednio liczba zmiennych wejściowych i ukrytych neuronów, p to zmienna wejściowa, bh to obciążenie warstwy ukrytej, a wh to waga warstwy ukrytej. Wydajność ekstrakcji kwasu elagowego, katechiny i epikatechiny w odniesieniu do czterech zmiennych niezależnych analizowano za pomocą ANN, najpierw trenując dane, a następnie wybierając najlepszy typ aktywacji i liczbę neuronów, co skutkuje odpowiednim dopasowaniem danych. Aby ocenić skuteczność modeli predykcyjnych, oszacowano trzy wartości: R-kwadrat, pierwiastek kwadratowy ze średniokwadratowego błędu predykcji (RASE) (równanie (2)) i średni błąd bezwzględny (AAE). RASE to RASE=̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅ SSE/n √ (2) Gdzie SSE przekazuje do kwadratu i sumuje błędy przewidywania (różnice między rzeczywistymi i przewidywanymi odpowiedziami) oraz n dla pewnej liczby obserwacji. R-kwadrat bliski 1 przy RASE i AAE bliskim zeru oznacza wyższe dopasowanie danych do modelu. 2.6. Statystyka Wydajność ekstrakcji fenolokwasów, flawonoli i flawanoli-3-oli została porównana z jednokierunkową analizą ANOVA, a następnie testem t Studenta przy p mniejszym lub równym 0,05 przy użyciu JMP Pro (wersja 14.2, SAS Institute Inc., Cary, Karolina Północna, USA). Każdy nde i 75 procent etanolu porównano stosując testy Dunnetta przy p mniejszym lub równym 0,05. Analiza głównych składników (PCA) została przeprowadzona na JMP Pro (wersja 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) dla związków fenolowych wyekstrahowanych ze skórki i nasion muskadyny. 3. Wyniki i dyskusja 3.1. Polifenole wyekstrahowane przez NDES ze skórek winogron muskadynowych Dziewięć NDES i 75% etanolu wykorzystano do ekstrakcji polifenoli ze skórek winogron muskadynowych. Tabela 2 przedstawia wydajność ekstrakcji kwasu elagowego, kwasu galusowego, kwasu ferulowego, mirycetyny, kwercetyny, kaempferolu, katechiny i epikatechiny. Najliczniej ekstrahowanym polifenolem w skórce winogron był kwas elagowy, a następnie odpowiednio kwas galusowy i kwas ferulowy. To odkrycie było zgodne z wcześniejszymi badaniami [17,18]. NDES #1, #8, #7, #3, #2 i #9 wyekstrahował znacznie większe ilości kwasu elagowego ze skórek winogron niż 75% etanolu. Najwyższą wydajność ekstrakcji kwasu elagowego osiągnięto przy użyciu NDES #1, a następnie NDES #8, odpowiednio 22,1 ± 2,2 mg/gi 21,3 ± 2,5 mg/g (Tabela 2). Jednak według testu t-Studenta nie było znaczącej różnicy między NDES #1 i NDES #8. Co ciekawe, stwierdzono, że NDES #1 jest najmniej skutecznym NDES do ekstrakcji antocyjanów z

wytłoki żurawinowe [14]. Sugerowało to, że NDES #1 może selektywnie ekstrahować kwas elagowy lub elagitaniny z matrycy żywności, która również zawiera antocyjanidyny. Taką selektywność można przypisać różnicom w interakcjach molekularnych między NDES a określonymi klasami fenolowymi. Rysunek S1 (panel A) przedstawia chromatogram HPLC kwasu galusowego, kwasu elagowego i kwasu ferulowego wyekstrahowanych ze skórki winogron przez NDES #1 i wykrytych przy 260 nm. Z 75-procentowego etanolu wyekstrahowano 12,7 ± 1,2 mg kwasu elagowego na gram skórki winogron. Najniższą wydajność ekstrakcji kwasu elagowego zaobserwowano w NDES #4 przy 7,44 ± 0,6 mg/g. Wydajność ekstrakcji kwasu galusowego przez NDES #9, #8, #1, #4, #7 i #3 była porównywalna i znacznie wyższa niż 75% etanolu. Najwyższa ilość kwasu galusowego została wyekstrahowana przez NDES #9 przy 10,4 ± 0,5 mg/g, podczas gdy najmniejsza ilość 5,55 ± {{40}} 0,1 mg/g wyekstrahowano za pomocą NDES #5. Najwyższa ilość kwasu ferulowego została wyekstrahowana przez NDES #1 przy 6,32 ± 0,7 mg/g, a najmniejsza ilość została wyekstrahowana przez NDES #5 przy 3,11 ± 0.{{5{{52 }}}} mg/g. Ponadto nie było znaczącej różnicy między NDES #1 a 75% etanolem w ekstrakcji kwasu ferulowego (Tabela 2). Największe ilości katechiny i epikatechiny zostały wyekstrahowane przez NDES #3 przy 0,61 ± 0,1 mg/g i 0,89 ± 0,1 mg/ g, odpowiednio (tabela 2). Tymczasem NDES #3 i #6 wyekstrahowały znacznie większe ilości epikatechiny niż 75% etanolu. Rysunek S2 (panel A) przedstawia chromatogram HPLC katechiny i epikatechiny wyekstrahowanych przez NDES #3 ze skórki winogron. Jednak katechiny nie wykryto w 75-procentowym ekstrakcie etanolowym. Najmniejsze ilości katechiny (0.02 mg/g) i epikatechiny ({{90}}.14 mg/g) zostały wyekstrahowane przez NDES #2 i NDES # 5, odpowiednio. Najliczniejszym flawonolem była mirycetyna, a najmniej kaempferolem. Test Dunnetta wykazał, że NDE i 75% etanol były porównywalne w ekstrakcji mirycetyny, kwercetyny i kaempferolu (Tabela 2). Największą ilość myrycetyny wyekstrahowano NDES #1 (1,84 mg/g), następnie 75% etanolem (1,73 mg/g), a następnie NDES #8 (1,67 mg/g). Największą ilość kwercetyny wyekstrahowano 75-procentowym etanolem (0.41 mg/g), NDES #1 (0.40 mg/g) i NDES #8 ({ {143}},38 mg/g). W przeciwieństwie do tego, najniższe ilości mirycetyny i kwercetyny zostały wyekstrahowane przez NDES #5 odpowiednio przy 0.87 mg/gi 0.27 mg/g. To odkrycie dodatkowo podkreśla ogólną słabą zdolność NDES #5 do ekstrakcji polifenoli ze skórki winogron. Największą ilość kemferolu wyekstrahowano 75% etanolem (0.05 mg/g), a najmniejszą wyekstrahowano NDES #5 i NDES#6 (0,03 mg/g). Rysunek S1 (panel B) przedstawia chromatogram HPLC myrycetyny, kwercetyny i kaempferolu wyekstrahowanych ze skórek winogron przez NDES #1 wykryty przy 360 nm. Najwyższa suma ilości kwasów fenolowych, flawonoli i flawanoli -3- wyniosła 40,7 mg/g wyekstrahowanych NDES #1, a następnie 39,8 mg/g wyekstrahowanych NDES #8, podczas gdy najniższa suma wyniosła 18,4 mg/g wyekstrahowanych przez NDES nr 5 (tabela 2). pH NDES wahało się od 0,3 do 3,3 (tab. 1). Korelację R-kwadrat między pH NDE a wydajnościami kwasów fenolowych, flawonoli i flawanoli-3-oli przedstawiono w tabeli 2. Brak korelacji między pH a wydajnością ekstrakcji sugerował, że pH nie miało wpływu na wydajność ekstrakcji. 3.2. Polifenole wyekstrahowane przez NDES z pestek winogron muskadynowych Ogólna wydajność ekstrakcji fenolokwasów, flawonoli i flawanoli- 3-oli z pestek winogron była zauważalnie niższa niż ze skórek (Tabela 3). Najliczniejszymi polifenolami, które można ekstrahować w nasionach, były katechiny i epikatechiny, natomiast kaempferol nie został wykryty. Złożona matryca nasion zawierająca olej (13% w/w suchej bazy) jest możliwym wyjaśnieniem niskiej ekstrahowalności związków fenolowych z pestek winogron [19]. Największą ilość katechiny wyekstrahowano NDES #3 przy 2,77 mg/g (Tabela 3). Wydajność ta była znacznie wyższa niż wszystkich innych NDES i 75% etanolu. Rysunek S2 (panel B) przedstawia chromatogram HPLC katechiny i epikatechiny wyekstrahowanych przez NDES #3 z pestek winogron. Najniższą ilość katechiny wyekstrahowano NDES #5 przy 0,30 mg/g. Wszystkie NDES oprócz NDES #1, #2 i #9 wyekstrahowały znacznie większe ilości epikatechiny niż 75% etanolu (Tabela 3). Najwyższe stężenia epikatechiny wyekstrahowano NDES #4 (0,71 mg/g) i NDES #5 (0,68 mg/g), podczas gdy najniższe wyekstrahowano 75% etanolem (0,11 mg/g). Najliczniej ekstrahowanym kwasem fenolowym w pestkach winogron był kwas galusowy, a następnie odpowiednio kwas ferulowy i kwas elagowy. Największą ilość kwasu galusowego wyekstrahowano NDES #4 przy 0,45 mg/g, a następnie NDES #9 i NDES #8. Te NDEs wyekstrahowały znacznie większe ilości kwasu galusowego niż 75% etanolu. Najniższą ilość kwasu galusowego (0,2 mg/g) wyekstrahowano za pomocą NDES #3. Najwyższa ekstrakcja

wydajność kwasu elagowego uzyskano przez NDES #9 (0,26 mg/g), a następnie przez NDES #6 (0,17 mg/g), które były znacznie wyższe niż 75 procent etanolu. Podobnie, NDEs #3 wyekstrahowały najniższą ilość kwasu elagowego w 0.05 mg/g. Ponadto NDES #6, #7 i #3 wyekstrahowały znacznie większe ilości kwasu ferulowego niż 75% etanolu. Najniższa wydajność ekstrakcji kwasu ferulowego wyniosła 0,5 mg/g według NDES #5. Ponadto kwas ferulowy nie został wykryty w ekstrakcie NDES #9. Było to prawdopodobne, ponieważ rozpuszczalność kwasu ferulowego była niższa w NDES #9 niż w innych NDEs. Najwyższy ekstrakt mirycetyny uzyskano przy 75% etanolu i NDES #7 przy 0.18 mg/g, które były wyższe niż wszystkie NDE. Najwyższa wydajność ekstrakcji kwercetyny była przez NDES #6 (0.14 mg/g) i NDES #3 (0,13 mg/g), a oba NDES były lepsze niż 75 procent etanolu. Podobnie, pH NDES nie miało wpływu na wydajność ekstrakcji, na co wskazuje niska korelacja (R-kwadrat) między pH NDE a wydajnością kwasów fenolowych, flawonoli i flawonoli-3-oli wymienionych w tabeli 3. 3.3 . Przeprowadzono analizę głównych komponentów (PCA) w celu powiązania wydajności ekstrakcji różnych związków fenolowych w skórce winogron i nasionach z NDE i 75% etanolem (ryc. 1). PCA przeprowadzono na macierzy korelacji, aby wykryć możliwą selektywność niektórych NDE w kierunku ekstrakcji określonych związków lub grup fenolowych. Około 85 procent wariancji danych dotyczących skóry zostało wyjaśnione przez główne składniki 1 i 2. Wykres obciążenia (ryc. 1B) pokazuje wysoką korelację między kwasami fenolowymi (kwas elagowy, kwas galusowy, kwas ferulowy) i flawonolami (mirycetyna, kwercetyna, i kemferol). Aby wyodrębnić te grupy, najlepszymi rozpuszczalnikami są NDES #1, #8, #7 i 75-procentowy etanol, jak pokazano na wykresie punktacji (ryc. 1A). Tymczasem katechina i epikatechina okazały się oddzielone od pozostałych grup fenolowych. Jak pokazano na ryc. 1A, NDES #3 był selektywny do ekstrakcji katechiny i epikatechiny ze skórek winogron. Była to interesująca obserwacja, ponieważ NDES#3 był jednym z najmniej skutecznych NDES w ekstrakcji proantocyjanidyn, które są oligomerami i polimerami katechiny i epikatechiny [14]. Sugerowało to, że NDES #3 może być selektywny wobec proantocyjanidyn o mniejszych rozmiarach cząsteczkowych. Skupianie związków fenolowych na wykresie obciążenia skórki (ryc. 1B) różniło się od nasion (ryc. 1D) niezależnie od niskich plonów tych związków w pestkach winogron. Pierwszy i drugi główny składnik wyjaśniały około 73% wariancji danych dotyczących nasion. Kwercetyna, mirycetyna i kwas ferulowy były wydajniej ekstrahowane przez NDES #6, #7 i 75% etanol, jak pokazano na wykresie punktacji (ryc. 1C). Kwas elagowy i kwas galusowy były skuteczniej ekstrahowane przez NDES #9. Po raz kolejny katechina została wyekstrahowana z najwyższą wydajnością przez NDES #3, która była podobna do tej obserwowanej w skórkach winogron. Epikatechina została wyekstrahowana z wyższą wydajnością przez NDES #5, #4 i NDES #8.

3.4. Optymalizacja ekstrakcji kwasów fenolowych i flawonoli ze skórek winogron muskadynowych oraz modelowanie predykcyjne ANN Chlorek choliny: kwas lewulinowy: glikol etylenowy 1:1:2 (NDES #1) wykazał najwyższą wydajność ekstrakcji dla kwasu elagowego, dlatego został wybrany do dalszej optymalizacji i Prognoza. W przypadku ekstrakcji kwasów fenolowych i flawonoli oceniono wpływ czterech czynników, w tym zawartości wody, czasu ultradźwięków, stosunku substancji stałych do rozpuszczalnika oraz temperatury ekstrakcji. Ponadto zastosowano cztery poziomy dla każdego czynnika ekstrakcji w sumie 4 0 losowych przebiegów. Eksperymentalna wydajność ekstrakcji kwasu elagowego, kwasu galusowego, kwasu ferulowego, mirycetyny i kwercetyny, wraz z sumą tych pięciu, przedstawiono w tabeli 4. Ogólnie rzecz biorąc, zakres różnicy wydajności ekstrakcji między najniższym a najwyższym był stosunkowo duży dla kwasów fenolowych. Na przykład najniższa wydajność kwasu elagowego wyniosła 9,03 mg/g (przebieg #17), a najwyższa 25,3 mg/g (przebieg #15), co skutkowało różnicą 16,2 mg/g (przebieg #17). Ponadto najniższa suma plonu wyniosła 20,7 mg/g, a najwyższa 71,5 mg/g. Ilustruje to znaczący wpływ różnych poziomów każdego czynnika ekstrakcji na wydajność ekstrakcji. W serii #15 wyekstrahowano największą ilość kwasu elagowego. Warunki ekstrakcji w serii nr 15 to 45 ml /10{{130}} ml wody, 25 min ultradźwięków, stosunek 1:10 (g: ml) ciała stałego do rozpuszczalnika , a temperatura ekstrakcji 60 ◦C. Rysunek S3 przedstawia chromatogram HPLC zoptymalizowanych kwasów fenolowych wyekstrahowanych ze skórki winogron metodą NDES #1 (próba nr 15 w Tabeli 4). Najwyższy poziom kwasu galusowego (18,7 mg/g) osiągnięto stosując warunki ekstrakcji w serii nr 24, a najniższy 6,63 mg/g w serii nr 40. W przypadku kwasu ferulowego, seria #22 wyekstrahowała najwyższą ilość przy 19,2 mg/g, podczas gdy kwasu ferulowego nie wykryto w seriach #14, #17, #29 i #34. Seria #22 została wyekstrahowana 60 ml/100 ml zawartości wody, 5 min ultradźwięków, 1:5 dla stosunku ciała stałego do rozpuszczalnika i temperatura ekstrakcji 60 ◦C. W serii #2 wyekstrahowano najwyższą mirycetynę (10,1 mg/g) i kwercetynę (1,87 mg/g). Warunki ekstrakcji w serii #2 to 60 mL/100 mL zawartość wody, 35 min ultradźwięków, 1:20 dla stosunku ciała stałego do rozpuszczalnika i temperatura ekstrakcji 60 ◦C. Najniższą moją pewną wydajność (3,79 mg/g) wyekstrahowano w serii nr 40. Wykresy konturowe na ryc. 2 pokazują wpływ parametrów ekstrakcji (X1, X2, X3 i X4) na przewidywaną wydajność kwasu elagowego wyekstrahowanego przez NDES #1 ze skórki winogron. Przewidywane wydajności kwasu elagowego w Tabeli 4 wykorzystano do skonstruowania tych wykresów liczenia. Każdy panel ilustruje wpływ 2 parametrów ekstrakcji. Linie konturowe są oznaczone wydajnością kwasu elagowego (mg/g). Optymalna przewidywana zawartość wody wynosiła około 35–45 ml/100 ml NDES, jak pokazano na rys. 2B i 2C. Dłuższy czas ultradźwięków zwiększył wydajność kwasu elagowego (ryc. 2D i 2E), wskazując na krytyczną rolę sonikacji w ekstrakcji NDES. Podczas ekstrakcji, mieszanie skórek winogron lub nasion z NDES wprowadziło cząstki i gaz, które dodały miejsca kawitacji akustycznej dla ultradźwięków, aby wygenerować wiele małych pęcherzyków w NDES. Implozja tych pęcherzyków doprowadziła do ekstremalnych temperatur, różnicy ciśnień, dużej siły ścinającej, makroturbulencji i mikromieszania, które skutecznie wstrząsały NDES, przyspieszając dyfuzję i transfer masy. Gdy bąbelki kawitacyjne implodowały na powierzchni cząstek pestek winogron lub skórki, powstałe mikrostrumienie i zderzenia między cząstkami prowadziły do ​​złuszczania się powierzchni, erozji, rozpadu cząstek, sonoporacji i rozerwania komórek [20]. Wszystkie te mechaniczne efekty kawitacji wywołanej ultradźwiękami zintensyfikowały penetrację NDE do wnętrza komórki, tak że międzykomórkowe fenole z matrycy żywności zostały przeniesione do rozpuszczalników. Optymalny stosunek ciała stałego do rozpuszczalnika wynosił 1:10, jak wskazano na Fig. 2B, 2D i 2F. Wreszcie, wyższe temperatury ekstrakcji do 60 ◦C wydają się mieć pozytywny wpływ na ekstrakcję kwasu elagowego, jak pokazano na rys. 2C, 2E i 2F. Sugeruje to bezpośredni związek między temperaturą ekstrakcji a wydajnością kwasu elagowego ekstrahowanego ze skórek winogron. Wydajność ekstrakcji kwasu elagowego (tabela 4) przeanalizowano pod kątem modelowania predykcyjnego przy użyciu sztucznych sieci neuronowych. Dane eksperymentalne zostały losowo podzielone na zestaw treningowy i zestaw walidacyjny. Powodem włączenia walidacji ustawionej przez oprogramowanie statystyczne jest wyeliminowanie nadmiernego dopasowania. Aby przewidzieć wydajność kwasu elagowego (Y), oceniono te same cztery niezależne czynniki ekstrakcji (X1, X2, X3 i X4), 1-2 ukryte warstwy o różnej liczbie neuronów oraz trzy funkcje aktywacji. Zastosowane funkcje aktywacji to tangens hiperboliczny, liniowa i gaussowska. Następnie zbiory danych były trenowane aż do osiągnięcia wysokiej wartości R-kwadrat zarówno dla trenowania, jak i walidacji. Wygenerowano dane predykcyjne i model. Najlepsza struktura SNN została wybrana poprzez analizę czterech wejść (X1, X2, X3 i X4) z jedną ukrytą warstwą przy użyciu funkcji Gaussa z dziesięcioma neuronami (rysunek S5). R-kwadrat zestawów uczących i walidacyjnych wyniósł 0,99, podczas gdy RASE i AAE modelu wyniosły odpowiednio 0,062 i 0,044. R-kwadrat walidacji ANN kwasu elagowego w tym badaniu (0,99) był wyższy niż walidacja ANN procyjanidyn (0,95) i antocyjanów (0,91) w poprzednim badaniu [14]. Jednak ten wzrost R2 można przypisać lepiej wygenerowanemu modelowi dopasowania danych w tym badaniu, co może być spowodowane mniejszymi błędami eksperymentalnymi. Modele prognostyczne ANN dla ekstrakcji kwasu elagowego przy użyciu NDES #1 przedstawiono jako równanie 3-13:

Cistanche na poprawę odporności

Wniosek

Aktualne odkrycia dostarczyły dalszych dowodów na skuteczność zdolności NDES do ekstrakcji polifenoli z produktów ubocznych przemysłu spożywczego. Wyniki potwierdziły hipotezę o lepszej ekstrakcji NDES wspomaganej ultradźwiękami ponad 75% etanolem. NDES skutecznie wyekstrahował trzy kwasy fenolowe, dwa flawonole i trzy flawonole-3-ole ze skórek i nasion winogron. NDES #1 był najskuteczniejszym NDES do ekstrakcji kwasu elagowego, podczas gdy NDES #3 był szczególnie selektywny w zakresie ekstrakcji katechiny i epikatechiny. Zauważalną wadą NDES jest ich wysoka lepkość, która stanowi wyzwanie podczas obsługi i odzyskiwania. W niniejszym badaniu sztuczna sieć neuronowa, niezależnie od jej ograniczeń wynikowych, wykazała praktyczne podejście do modelowania predykcyjnego. NDEs to solidne media do odzyskiwania fitochemikaliów z systemów żywnościowych. Niektóre NDEs również prezentują mniej toksyczny rozpuszczalnik do badania tych fitochemikaliów w żywych komórkach [21,22]. Wreszcie, naturalne głęboko eutektyczne rozpuszczalniki są skutecznymi alternatywnymi mediami ekstrakcyjnymi do rozpuszczalników organicznych.

Bibliografia

[1] W. Bi, M. Tian, ​​KH Row, Ocena zawartości alkoholu głęboko eutektycznego w ekstrakcji i oznaczanieflawonoidyz optymalizacją metodologii powierzchni odpowiedzi, J. Chromatogr. A 1285 (2013) 22-30, https://doi.org/10.1016/j. kolor.2013.02.041.
[2] M. Cvjetko Bubalo, N.´Curko, M. Tomaˇsevi´c, K. Kovaˇcevi´c Ghani's, I. Radojˇci´c Redovnikovi´c, Zielona ekstrakcja fenoli ze skórek winogron przy użyciu głęboko eutektycznych rozpuszczalników, Food Chem. 200 (2016) 159–166, https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2016.01.040.
[3] M. Panic, V. Gunjevi´c, G. Cravotto, I. Radojˇci´c Redovnikovi´c, Technologie umożliwiające ekstrakcję antocyjanów z wytłoków winogronowych przy użyciu naturalnych głęboko eutektycznych rozpuszczalników w partiach do pół litra ekstrakcja antocyjanów z wytłoków winogronowych za pomocą NADES, Food Chem. 300 (2019) 125185, https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.125185.
[4] M. Hoffmann i in., Muscadine Grape Production Guide for the Southeast, North Carolina State University, NC State Extension Publications, 2020 https://content. ces.ncsu.edu/muscadine-grape-production-guide (dostęp 18 stycznia 2021 r.). [5] Cline, B. i C. Fisk, Przegląd areału, odmian i obszarów produkcyjnych winorośli muskadynowych w południowo-wschodnich Stanach Zjednoczonych. Warsztaty Muscadine Grape dla spółdzielczych agentów przedłużających, w Konsorcjum Małych Owoców Regionu Południowego. 2006: Konsorcjum Małych Owoców Regionu Południowego.
[6] PC Andersen A. Sarkhosh D. Huff J. Breman 2020 6 10.32473/edis-hs100-2020.
[7] P. Greenspan i wsp., Przeciwzapalne właściwości winogron muskadynowych (Vitis rotundifolia), J. Agric. Żywność. Chem. 53 (22) (2005) 8481–8484, https://doi.org/10.1021/jf058015.
[8] DN Ignacio, KD Mason, EC Hackett-Morton, C. Albanese, L. Ringer, WD Wagner, PC Wang, MA Carducci, SK Kachhap, CJ Paller, J. Mendonca, L. Li Ying Chan, Bo Lin, DK Hartle, JE Green, CA Brown, TS Hudson, ekstrakt ze skórki winogron Muscadine hamuje komórki raka prostaty, indukując zatrzymanie cyklu komórkowego i zmniejszając migrację przez białko szoku cieplnego 40, Heliyon 5 (1) (2019) e01128, https://doi .org/10.1016/j.heliyon.2019.e01128.