Zrozumienie sortowania po wpisie kapsydów adenowirusa; Szansa na zmianę właściwości wektora szczepionki Część 1

Abstrakcyjny:

Szczepionki genetyczne oparte na wektorach adenowirusowych okazały się potężną strategią walki z kryzysem zdrowotnym związanym z SARS-CoV-2. Ten sukces nie jest nieoczekiwany, ponieważ adenowirusy łączą w sobie wiele pożądanych cech szczepionki genetycznej. Są wysoce immunogenne i mają niski i dobrze scharakteryzowany profil patogenny w połączeniu z przystępnością technologiczną. Trwające wysiłki mające na celu ulepszenie wektorów adenowirus-szczepionka obejmują stosowanie rzadkich serotypów i adenowirusów innych niż ludzkie. W tym przeglądzie skupiamy się na kapsydzie wirusowym i na tym, jak wybór genotypów wpływa na pobieranie i późniejsze sortowanie subkomórkowe. Opisujemy, w jaki sposób zrozumienie właściwości kapsydu, takich jak stabilność podczas procesu wejścia, może zmienić los wchodzących cząstek i jak to przekłada się na różnice w wynikach odporności. Omawiamy szczegółowo, w jaki sposób mutacja błonowego białka kapsydu litycznego VI wpływa na sortowanie po wejściu wirusów gatunku C i krótko omawiamy, czy takie podejścia mogą mieć szersze implikacje w rozwoju szczepionek i / lub wektorów.

Kliknij czystą cistancheprodukt

For more information:1950477648nn@gmail.com

1. Wstęp

Infekcje wirusowe, w przeciwieństwie do infekcji bakteryjnych, które można leczyć antybiotykami, pozostają zagrożeniem dla zdrowia, ponieważ istnieje bardzo niewiele środków przeciwwirusowych. Dlatego szczepienie jest jedyną szeroko stosowaną strategią ochrony populacji ludzi (i zwierząt) przed infekcjami wirusowymi.

Do niedawna szczepienie przeciwko infekcjom wirusowym było rozważane głównie w kontekście zapobiegania chorobom wieku dziecięcego lub jako coroczna szczepionka przeciw grypie w celu zapobiegania zakażeniom grypowym. Wraz z wybuchem kryzysu zdrowotnego SARS-CoV-2 w 2020 r. szczepienia wróciły do ​​centrum uwagi opinii publicznej, ponieważ są obecnie postrzegane jako jedyne trwałe wyjście z tej pandemii. W tym kontekście szczepionki oparte na wektorach adenowirusowych (Ad) okazały się jedną z dwóch głównych skutecznych strategii szczepień. Po nagłym zatwierdzeniu szczepionki Ad są teraz wstrzykiwane dużej części populacji Ziemi w ramach bezprecedensowego wysiłku na rzecz zainstalowania planetarnej odporności na SARS-CoV-2.

Szczepionki zawierające wektory adenowirusowe nie były szeroko stosowane przed wybuchem epidemii COVID{0}}, ale ich sukces nie jest nieoczekiwany. Wirusy są na ogół bardzo odpowiednimi platformami szczepionkowymi. Są biologicznie zoptymalizowane i przystosowane do transportu kwasów nukleinowych oraz wywołują reakcje immunologiczne. Adenowirusy mają wiele cech, które czynią je szczególnie idealnymi kandydatami na szczepionki. Mają niski i dobrze scharakteryzowany profil chorobotwórczy w połączeniu z wysoką zakaźnością. Są dostępne technologicznie i były szeroko stosowane do wektoryzacji. Ich wysoka wydajność produkcyjna i stabilność umożliwiają produkcję przemysłową w warunkach dobrej praktyki produkcyjnej (GMP) i zapewniają praktyczne cechy (tj. przechowywanie) do dystrybucji regionalnej po obniżonych kosztach [1]. Co więcej, dostarczanie komórek Ad do komórek prezentujących antygen jest skuteczne i naturalnie wywołują one wrodzoną odpowiedź immunologiczną, która działa jako adiuwant zwiększający skuteczność szczepienia [2,3].

Zrozumienie biologii Ad było kluczowe w opracowywaniu wektorów opartych na Ad (szczepionkach). Na przykład użycie serotypów innych niż ludzkie lub rzadkich serotypów Ad w niektórych obecnie sprzedawanych szczepionkach SARS-CoV-2 zostało celowo wybrane, aby zapobiec zmniejszeniu skuteczności szczepionki przez istniejącą wcześniej odporność na wektory. Zastosowanie wektorów z usuniętymi genami wirusowymi zapewnia lepsze bezpieczeństwo wektorów. Jednak nadal istnieje wiele aspektów cyklu życiowego wirusa, które nie zostały uwzględnione podczas opracowywania wektorów szczepionek opartych na reklamach, a wiedza na temat rzadkich lub innych niż ludzkie genotypów jest ograniczona, w tym genotypów obecnie stosowanych jako szczepionki przeciwko SARS-CoV{8}} . Dzięki tej recenzji chcielibyśmy podnieść świadomość potencjalnych modyfikacji, które można wykorzystać podczas opracowywania wektorów Ad do celów medycznych, w tym szczepień.

Skupiamy się na kapsydzie wirusowym i na tym, jak wybór genotypów wpływa na pobieranie i późniejsze sortowanie subkomórkowe. Opisujemy, w jaki sposób zrozumienie właściwości kapsydu, takich jak stabilność podczas procesu wejścia, może zmienić los wchodzących cząstek i jakie różne wyniki odporności są obserwowane. Jako przykład tego, jak można zmienić stabilność i los kapsydu, szczegółowo omawiamy, w jaki sposób mutacja błonowego białka kapsydu litycznego VI wpływa na wirusy gatunku C. Na koniec krótko omawiamy, czy takie podejścia mają potencjał do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek i / lub wektorów.

1.1. Adenowirusy stanowią zróżnicowaną rodzinę patogenów zakaźnych

Historycznie Ad został po raz pierwszy wyizolowany w 1953 roku z migdałków pacjentów z infekcjami dróg oddechowych [4], a wkrótce potem powszechnie przyjęto termin „adenowirus” [5]. Rodzina Adenoviridae liczy ponad 120 członków, podzielonych na pięć rodzajów – w zależności od tego, czy infekują ssaki (np. Mastadenoviridae), ptaki (np. Aviadenoviridae), gady (np. Atadenoviridae), płazy (Siadenoviridae) czy ryby (Ichtadenoviridae). ) [6,7]. Rodzaj Mastadenoviridae obejmuje również ponad 70 rodzajów ludzkich Ads [8,9], które są podzielone na siedem gatunków (A-G), zgodnie z ich właściwościami morfologicznymi, biologicznymi i fizykochemicznymi, jak wymieniono w tabeli 1 [10, 11].

Co więcej, Ads mogą również spontanicznie rekombinować, tworząc w ten sposób nowe gatunki [12], jak miało to miejsce w przypadku AdE4, który jest jedynym ludzkim wirusem gatunku E i prawdopodobnie powstał w wyniku rekombinacji między ludzkim gatunkiem B a małpim Ad [13 ]. Chociaż infekcje u ludzi reklamami innymi niż ludzkie są naturalnie rzadkie, nie są niemożliwe [14,15]. Zdolność różnych reklam innych niż ludzkie do infekowania (lub transdukcji) ludzkich komórek czyni je atrakcyjnymi (szczepionkowymi) platformami wektorowymi. Wśród nich są reklamy wywodzące się od szympansów [16–18], goryli [19], owiec [20], krów [21], psów [21,22] czy małp z Nowego Świata [23].

Infekcje adenowirusami mogą powodować różne patologie w zależności od ich tropizmu komórkowego lub tkankowego, w tym choroby układu oddechowego, oczu, dróg moczowych lub przewodu pokarmowego (patrz Tabela 1). Tropizm tkankowy jest często wynikiem odmiennego wykorzystania receptorów przez różne reklamy i może być również związany z wewnętrzną stabilnością cząstek [24]. Większość infekcji Ads jest łagodna lub bezobjawowa u gospodarza z prawidłową odpornością. Pierwotne infekcje Ad występują głównie w dzieciństwie i skutkują silną odpornością ochronną. Natomiast u osób z obniżoną odpornością reklamy mogą powodować niekontrolowane, ciężkie i zagrażające życiu infekcje ogólnoustrojowe prowadzące do poważnej toksyczności komórkowej, co może skutkować nadmiernym stanem zapalnym i niewydolnością wielonarządową, powodując wysoką śmiertelność [12].

Najlepiej zbadanymi ludzkimi wirusami Ads są wirusy typu C typu 2 i 5, które występują głównie u pacjentów z infekcjami górnych dróg oddechowych i przewodu pokarmowego [25] i które będą głównym tematem tego przeglądu. Adenowirusy mogą być odpowiedzialne za sporadyczne wybuchy epidemii, takie jak wirusy gatunku B wywołujące zapalenie płuc (np. Ad3, 7 i 14) wśród osób z prawidłową odpornością [26] lub Ad40/41 gatunku F oraz Ad12, 18 i 31 gatunku A , które infekują przewód pokarmowy (przegląd w [26,27]). Wirusy z gatunku D stanowią bardzo zróżnicowaną grupę i mają skłonność do rekombinacji oraz są główną przyczyną infekcji oka [28].

1.2. Kapsydy adenowirusa to struktury metastabilne

Pomimo swojej różnorodności wszystkie Reklamy mają podobne ramy strukturalne i organizacyjne. Adenowirusy to bezotoczkowe wirusy DNA zawierające stosunkowo duży, liniowy, dwuniciowy genom DNA o długości 26–45 kb [29–31]. Kapsyd ma średnicę ~70–90 nm i ma postać dwudziestościanu o 20 ściankach i 12 wierzchołkach [32]. Kapsyd składa się z trzech głównych białek strukturalnych (hekson, penton i włókno) oraz różnych mniejszych białek cementujących (tj. IIIa, VI, VIII i IX w wirusach gatunku C), które stabilizują strukturę. Strukturę kilku kapsydów Ad o wysokiej rozdzielczości uzyskano za pomocą kriomikroskopii elektronowej i krystalografii rentgenowskiej [24,33–36]. Kapsyd dwudziestościenny ma strukturę pseudo-T25 z 720 egzonami złożonymi w różne trymery w zależności od ich położenia w kapsydzie. 20 fasetek kapsydu składa się z dziewięciu połączonych eksonów (tzw. GON dla grupy dziewięciu), podczas gdy na 12 wierzchołkach eksony są złożone w GOS (dla grupy sześciu) ). Pentameryczna podstawa pentona jest umieszczona w 12 wierzchołkach i służy jako podstawa dla wystającego włókna trimerycznego [39,40]. Interakcja między głównymi i mniejszymi białkami kapsydu stabilizuje kapsyd, głównie poprzez interakcję z sześciokątami.

Na przykład GON jest stabilizowany przez IX [41]; IX i IIIa same są stabilizowane przez ich interakcję z VIII, co łączy je odpowiednio z GOS i GON [37]. Cząsteczki VIII zarysowują GON i pomagają stabilizować sześciokąty po wewnętrznej stronie kapsydu. Białko VI stabilizuje również hekson poprzez wiązanie środkowej jamy trimeru heksonu wystawionej na działanie wewnętrznego światła wirusa [42-44].

Kapsyd otacza i chroni rdzeń wirusa składający się z genomu wirusa, białek rdzenia wirusa (tj. V, VII, Mu w wirusach gatunku C) oraz białka końcowego (TP), które jest kowalencyjnie związane z każdym końcem 5' genom Ad. Mniejsze białka kapsydu oddziałują z białkami rdzeniowymi, ustanawiając połączenie między kapsydem a genomem; jednak ich organizacja przestrzenna wśród białek rdzeniowych pozostaje słabo poznana. Wykazano, że V utrzymuje DNA wewnątrz kapsydu poprzez interakcję z VI (po stronie kapsydu) i VII (po stronie genomu) [45–47] i prawdopodobnie przyczynia się do uwalniania genomu w porach jądrowych [48]. VII jest głównym białkiem kapsydu związanym z wirusowym DNA i promuje jego kondensację wewnątrz kapsydu [49-51]. VII chroni również genom wirusa przed wykryciem immunologicznym przez czynniki komórkowe [50,52-54]. Co ciekawe, białko kapsydu IX i białko V są obecne tylko w Mastadenoviridae [55,56], a kapsydy wirusowe mogą być wytwarzane bez IX [57] lub białka VII [58], wykazując pewną elastyczność w strukturze kapsydu.

Genom ludzkiego Ads koduje około 45 białek (w tym białka strukturalne), zorganizowanych w czasowo regulowane jednostki transkrypcyjne [59]. Czynnik transkrypcyjny E1A jest pierwszym białkiem ulegającym ekspresji i jest niezbędny do zainicjowania ekspresji genów wirusowych [60]. Genom zawiera również sekwencję enkapsydacji 5' i odwrócone powtórzenia końcowe (ITR) na każdym końcu, które są wymagane do replikacji [59,61-64]. Adenowirusy kodują proteazę adenowirusową (AVP), która jest upakowana w cząsteczkę i przetwarza kilka białek (tj. IIIa, VI, VII, VIII, μ, TP i 52.55K w wirusach gatunku C) [65-67]. Ten etap jest wymagany do tworzenia dojrzałych cząstek zakaźnych i indukuje tworzenie metastabilnych (tj. mniej stabilnych) kapsydów przygotowanych do demontażu kapsydu po przyłączeniu i wejściu komórki [68,69]

Istnieją również specyficzne gatunkowo różnice w budowie ludzkich Ads, np. w długości włókien i elastyczności, co bezpośrednio wpływa na wiązanie receptora [70–72]. Różnice można również zaobserwować w montażu pentona. Pentony wirusów gatunku B mogą tworzyć kontakty między pentonami, w wyniku czego powstają alternatywne i mniej stabilne cząstki wirusopodobne, które są pozbawione genomów i czasami bez włókien. Takie cząstki nazywane są dwunastościanami i są badane pod kątem przenoszenia plazmidów lub peptydów do komórek jako alternatywa dla wektorów Ad. Dwunastościany lepiej eksponują motyw krótkiego peptydu RGD obecny w pentonie większości gatunków Ad, który jest wymagany do wiązania komórek docelowych [73,74]. Różnice w stabilności kapsydu, jak omówiono poniżej, mogą być ważną właściwością, która określa los wejścia cząstek Ad.

1.3. Adenowirusy podążają litycznym cyklem życia

Cykl infekcji Ad został obszernie przeanalizowany w innym miejscu [75–77]. Tutaj krótko skupimy się na początkowej części cyklu życiowego i, o ile nie zaznaczono inaczej, będziemy odnosić się do wirusów gatunku C, które są najlepiej zbadane (ryc. 1). Adenowirusy wykorzystują włókno kapsydu jako pierwotną cząsteczkę przyłączającą się do komórki. Większość Ad, w tym wirusy z gatunku C, wykorzystuje wirusa Coxsackie i receptor Ad (CAR) do wiązania komórek docelowych [78-81]. W przeciwieństwie do tego, niektóre wirusy z gatunku B preferencyjnie wiążą się z receptorem CD46 [82] lub desmogleiną 2 [83], a niektóre wirusy z gatunku D wykazano, że oddziałują z kwasami sialowymi [84,85] lub bezpośrednio z integrynami v (patrz Tabela 1) [ 86].

Zatem przełączanie włókien między gatunkami jest atrakcyjną strategią zmiany tropizmu [87–89]. Podstawową rolą cząsteczki błonnika jest pośredniczenie w fizycznym połączeniu z komórkami docelowymi, po którym następuje druga interakcja między pentonem a integrynami, taka jak v 5 [90]. W interakcji tej pośredniczy motyw peptydowy RGD w sekwencji pentonowej [91]. Brak tego motywu, podobnie jak w wirusach gatunku F, wiąże się z mniej wydajnym wejściem do komórki [92]. Wiązanie integryny powoduje skupienie się integryny na powierzchni komórki [93], co uruchamia kaskadę sygnalizacyjną prowadzącą do reorganizacji cytoszkieletu aktynowego [94,95] i wychwytu endocytarnego poprzez endocytozę za pośrednictwem klatryny lub mikropinocytozę [96,97]. Wiązanie RGD może również destabilizować kapsyd [98], zmniejszając kontakt między pentonem a heksonem, pomagając kapsydowi w usuwaniu powłoki [99]. W konsekwencji cząsteczki Ad tracą swoje włókno, a wewnątrz endosomu można znaleźć zdysocjowany hekson i penton [100–102]. Endosom to dynamiczna organella przygotowana do dojrzewania do degradujących lizosomów, a reklamy muszą szybko uciec do cytozolu. Zakwaszenie endosomu może przyspieszyć proces ucieczki poprzez dalsze osłabienie kapsydu [100,103]. Proces penetracji endosomu polega na uwolnieniu wewnętrznego białka kapsydu VI [103,104].

Uwolniony VI charakteryzuje się amfipatyczną helisą na końcu N, która wiąże się z wewnętrznym płatkiem endosomu i indukuje dodatnią krzywiznę błony, co powoduje miejscowe pęknięcie błony [75,103,105,106]. Komórki reagują na pęknięcie błony wywołane wirusem i aktywują zlokalizowaną odpowiedź autofagii, aby oczyścić uszkodzoną organellę [107-109]. Aby uniknąć degradacji, Ads opóźnia autofagię poprzez krótki motyw peptydowy PPxY w białku VI, dopóki cząstka nie osiągnie bezpieczeństwa cytozolu [104,108]. Wykazano, że wirusy gatunku C uciekają z wczesnych endosomów [110]. Inne gatunki, w tym A, B i D, najpierw przemieszczają się do lizosomu przed ucieczką do cytozolu [111-113], co może wpływać na aktywację immunologiczną wyzwalaną przez te wirusy [114].

Gdy reklamy dotrą do cytozolu, angażują się w silniki dyneinowe i wykorzystują transport wsteczny wzdłuż mikrotubul, aby dotrzeć do centrum organizacji mikrotubul [115-117]. Wiązanie motoryczne prawdopodobnie odbywa się za pośrednictwem heksonu [115] i może wymagać kwaśnego primingu [118]. W pobliżu jądra kapsydy zmieniają kierunek transportu, prawdopodobnie przez wiązanie się z białkami motorycznymi kinezyny i gromadzenie się w otoczce jądrowej [115,117,119,120]. Dokują w kompleksie porów jądrowych, następnie kapsydy są całkowicie rozkładane, a genomy są uwalniane i importowane do jądra [51,121-124]. Po wejściu do jądra cykl jest kontynuowany przez aktywację transkrypcji genomu i ekspresję natychmiastowego wczesnego genu E1A, który służy jako czynnik transkrypcyjny dla wszystkich innych wczesnych jednostek transkrypcyjnych [60,125-130]. Po ekspresji enzymów replikacyjnych genomy wirusowe ulegają replikacji i gromadzą się na obrzeżach centrów replikacji [131].

Następnie białka strukturalne ulegają ekspresji z późnej jednostki ekspresyjnej pod kontrolą głównego późnego promotora [132, 133]. Ekspresja późnych genów kończy się produkcją i akumulacją jądrową wszystkich białek strukturalnych, gdzie łączą się one w potomstwo i pakują nowo zsyntetyzowane genomy. Montaż jądrowy następnej generacji reklam powoduje następnie wydostawanie się cząstek i lizę komórek [42,134–136]. Jak wspomniano powyżej, po złożeniu kapsydów następuje dojrzewanie, tj. proteolityczne rozszczepienie kilku białek kapsydu przez AVP w celu wytworzenia zakaźnych cząstek [66]. Znaczenie tego procesu ilustruje mutant wrażliwy na temperaturę, Ts1, początkowo zidentyfikowany na ekranie mutagenezy w Ad2. W niedopuszczalnej temperaturze mutant ten nie upakuje AVP, a złożone cząstki nie przechodzą dojrzewania, co skutkuje hiperstabilnymi cząstkami [137]. Odpowiedzialna mutacja AVP została genetycznie wprowadzona do Ad5 zachowując ten fenotyp. Kapsydy Ts1 są nadal zdolne do przyłączania się do receptorów komórkowych i ulegania endocytozie, ale pozostają uwięzione w endosomie z powodu niezdolności do uwolnienia białka VI [103,138,139].

2. Wykrywanie immunologiczne adenowirusa

Adenowirusy są szeroko rozpowszechnione i znaczna większość populacji zetknęła się z tym wirusem, głównie w dzieciństwie. Adenowirusy są wysoce immunogenne, a każde zetknięcie prowokuje rozwój swoistej odporności na Ad, zarówno wrodzonej, jak i adaptacyjnej, która może trwać przez całe życie. Jest to ważne w walce z wirusem i sprawia, że ​​reklamy są mniej szkodliwe dla gospodarza z prawidłową odpornością, ale może to stanowić przeszkodę, gdy reklamy mają być używane jako wektor w wakcynologii lub terapii genowej [140,141]. Zrozumienie, w jaki sposób Ad (i jego pochodne wektorowe) aktywuje układ odpornościowy, pozwoli nam poprawić skuteczność i bezpieczeństwo szczepionek. Obserwacje in vivo od pacjentów uczestniczących w badaniach klinicznych wyraźnie wykazały, że wektory oparte na Ad mogą indukować silną aktywację immunologiczną [142,143], czasami ze śmiertelnymi konsekwencjami [144].

Ponadto różne badania przeprowadzone in vitro lub na modelach zwierzęcych [145] sugerują kluczową rolę samej cząsteczki wirusa (tj. kapsydu i inkorporowanego DNA) w aktywacji początkowej odpowiedzi immunologicznej. Tutaj pokrótce skupimy się na odpowiedziach immunologicznych związanych z wejściem kapsydu; bardziej dogłębny przegląd można znaleźć w opublikowanych wcześniej recenzjach [146–149].

2.1. Adenowirusy wyzwalają wewnętrzną odporność komórki

Wraz z rozwojem Ads jako wektorów stało się jasne, że wewnętrzna lub wrodzona odporność komórkowa indukowana przez Ads jest odpowiedzią na atakujący wirion. Co ciekawe, zarówno wirusy replikujące, jak i niereplikujące (tj. wirusy inaktywowane UV, wektory niereplikujące lub puste kapsydy) aktywują odpowiedzi immunologiczne w zainfekowanych komórkach, co pokazuje, że kapsyd odgrywa kluczową rolę w tej odpowiedzi [145, 150–156]. .

Ogólnie rzecz biorąc, reklamy są wykrywane przez komórki na kilku etapach całego cyklu życiowego wirusa i aktywują szlaki odporności wrodzonej (ryc. 1). Ta aktywacja rozpoczyna się od związania włókna Ad z receptorem CAR na powierzchni komórki, co aktywuje sygnalizację kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK), która prowadzi do aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-κB. Ten czynnik wyzwalający powoduje wytwarzanie cytokin prozapalnych (IL-6, IL-8) [157,158]. Jednakże, w zależności od gatunku Ad, wykorzystanie innych receptorów może modulować siłę kaskady sygnalizacyjnej zaangażowanej w ekspresję cytokin [159]. Interakcja między pentonem wirusowym a integryną komórkową jest kolejnym wyzwalaczem aktywacji immunologicznej. Badanie na mysich makrofagach wykazało, że to wiązanie aktywuje ekspresję IL-1 poprzez motyw RGD [160]. Może to być ograniczone do komórek odpornościowych, ponieważ w innych modelach komórkowych (np. HeLa, linia komórek nabłonkowych) nie potwierdzono roli interakcji integryna/RGD w produkcji chemokin i cytokin prozapalnych [151,161,162]. Sugeruje to ważniejszą rolę samego procesu internalizacji w aktywacji immunologicznej niż interakcja z integrynami. Rzeczywiście, wiązanie pentonu z integryną aktywuje również sygnalizację kinazy fosfoinozytydu 3- (PI3K) w celu zwiększenia internalizacji wirusa [163].

Ponadto wykazano, że aktywacja PI3K po infekcji Ad wyzwala produkcję cytokin prozapalnych, takich jak TNF [164], a proces internalizacji opisano jako wymagany do aktywacji immunologicznej [165]. Badania te sugerują, że aktywacja immunologiczna zachodzi głównie na etapie po internalizacji, podkreślając znaczenie sortowania po wejściu (przegląd w [166]).

Po dostaniu się do endosomu Ads są wystawione na działanie wewnątrznaczyniowych receptorów rozpoznawania patogenów (PRR), takich jak TLR9, który jest dwuniciowym czujnikiem DNA ograniczonym do komórek odpornościowych. Mysie makrofagi mogą wykrywać wektory Ad poprzez TLR9, aby indukować produkcję cytokin prozapalnych [167]. TLR9 był również ściśle wymagany do produkcji IFN/, gdy mysie plazmacytoidalne komórki dendrytyczne (pDC) prowokowano Ad [168]. Jednak w modelach myszy z nokautem TLR9 IFN był nadal wytwarzany, co sugeruje, że w komórkach innych niż pDC produkcja IFN zachodzi niezależnie od sygnalizacji TLR9 [168,169].

Genomy wirusowe (lub genomy wektorowe) stają się dostępne dla wykrywania podczas lub po ucieczce wirusa z endosomu. Po dotarciu do cytozolu są wykrywane przez cytozolowy czujnik dwuniciowego DNA cGAS [168, 170]. Po rozpoznaniu genomu wirusowego cGAS promuje fosforylację i translokację jądrową czynnika transkrypcyjnego IRF3 w celu kierowania ekspresją IFN/, indukując stan przeciwwirusowy. Pasaż endosomalny wymaga uszkodzenia błony endosomalnej wywołanej wirusem, aby ułatwić ucieczkę cząstek wirusowych z endosomu. Pęknięcie błony znacząco przyczynia się zatem do aktywacji immunologicznej, co podkreśla fakt, że wadliwy mutant Ts1 nie aktywuje pełnej i skutecznej odpowiedzi immunologicznej [161,162,170,171]. Kluczową rolę w odpowiedzi zapalnej po penetracji błony Ad odgrywa kinaza wiążąca zbiornik, TBK1, co sugeruje, że jest częścią cytozolowego wykrywania genomu wirusowego w dół szlaku cGAS / STING [168, 170].

Uszkodzenie błony adenowirusa powoduje również uwolnienie katepsyny B z kompartmentu endolizosomalnego, powodując stres oksydacyjny, który aktywuje inflamasom NLRP3, powodując dojrzewanie IL-1 [114]. Wirusy gatunku C uciekają z wczesnych endosomów, podczas gdy wirusy gatunku B przemieszczają się aż do późnych endosomów, prawdopodobnie z powodu różnic w wykorzystaniu receptorów. Zakwaszenie późnego endosomu/lizosomu z większym prawdopodobieństwem aktywuje kwaśne hydrolazy lizosomalne. Oba gatunki indukują aktywację inflamasomu [172], ale prawdopodobnie ze względu na czas przebywania w endosomie zakres ich odpowiedzi jest różny. Ogólnie wirusy gatunku B indukują silniejszą wrodzoną i adaptacyjną aktywację immunologiczną niż wirusy gatunku C [113,173,174]. To może wyjaśniać, dlaczego wirusy gatunku B są bardziej patogenne, powodując wybuchy u gospodarzy z prawidłową odpornością [26]. Sugeruje to ponadto, że komórki mogą rozróżnić przedział penetracji (tj. endosom vs. lizosom, [109]) i dostosować skuteczność odporności. Uszkodzenie błony endosomalnej podczas procesu ucieczki Ad może być samo w sobie sygnałem zagrożenia. Jak omówiono szczegółowo poniżej, uszkodzenie błony powoduje ekspozycję cytozolową glikanów wewnątrz światła, które są wykrywane przez komórkę jako sygnały niebezpieczeństwa (jak omówiono w [109]). Wykrywanie eksponowanych glikanów przez galektyny następnie aktywuje autofagię, wyzwalając drugą gałąź odporności przeciwwirusowej [108].

2.2. Adenowirusy wywołują adaptacyjną odpowiedź immunologiczną i odwracają antywirusową autofagię po wejściu do komórki

Wrodzone odpowiedzi immunologiczne wywołane przez Ad lub ich wektory następnie przekładają się na odporność nabytą poprzez wydzielanie chemokin, które przyciągają komórki odpornościowe (neutrofile, komórki NK i makrofagi) i wzmacniają silną prezentację antygenu [153,154]. Adenowirusy są wysoce immunogenne, a ich głównymi immunogenami są główne białka kapsydu (hekson, penton i błonnik), które wyzwalają specyficzną dla gatunku produkcję neutralizujących przeciwciał przez limfocyty B [175-177].

Przeciwciała neutralizujące są głównie skierowane przeciwko hiperzmiennym pętlom białka heksonu [178-180] i stanowią główne ograniczenie w stosowaniu Ads jako wektorów pochodzących z tego samego serotypu. Ten problem został ominięty przez zastosowanie mniej seroprewalentnych lub innych niż ludzkie reklamy [181-185]. Pomimo tej odporności przeciwwektorowej, gdy Ads są wykorzystywane jako platformy szczepionek (np. w celu wywołania ochrony immunologicznej przeciwko wirusowi Ebola w badaniach klinicznych), nadal indukują silną odpowiedź limfocytów B, umożliwiając wytwarzanie przeciwciał przeciwko pożądanemu immunogenowi szczepionki, który może trwać do 6 miesięcy [186]. Ponadto istniejącą wcześniej odporność wektora można przezwyciężyć wyższymi dawkami wektora szczepionki, jak w przypadku wektora szczepionki SARS-CoV{11}} opartej na wysokiej seroprewalencji AdC5 [187].

Podobnie jak w przypadku przeciwciał neutralizujących, infekcje Ad wyzwalają trwałą odporność komórek T, głównie poprzez aktywację CD4 plus. Ochronę tę można nadal znaleźć u dorosłych, co sugeruje długotrwałą odporność od dzieciństwa [188–190]. Ponadto opisano również aktywację CD8 plus w celu utrzymania odpowiedzi cytotoksycznej [191-193]. Ta aktywacja komórek T niekoniecznie jest specyficzna dla serotypu i umożliwia krzyżową ochronę przed różnymi podgrupami i serotypami Ad [192-194].

Ponadto u pacjentów z przeszczepionymi komórkami macierzystymi zakażonych Ad opisano silną aktywację CD4 plus i CD8 plus [195]. Ta aktywacja jest skierowana przeciwko peptydom heksonu i prowadzi do usunięcia wiremii Ad, co podkreśla główną rolę aktywacji limfocytów T zarówno CD4 plus, jak i CD8 plus w ochronie immunologicznej. Podczas gdy ta odporność oparta na komórkach T jest skierowana przeciwko cząstce Ad, reklamy również wyzwalają silną odporność komórkową opartą na odpowiedzi komórek T na antygen szczepionkowy, co jest zaletą dla długotrwałej odporności przy stosowaniu rekombinowanych wektorów Ad jako platform szczepionek [196,197 ]. Co ważne, dane z badań klinicznych potwierdziły, że gdy Ad jest stosowany jako platforma szczepionki (z pożądanym antygenem jako transgenem), indukuje zarówno cytotoksyczną aktywację limfocytów T CD8 plus, jak i limfocytów T CD4 plus, prowadząc do odporności na pamięć przeciwko eksprymowany transgen [184,186,198-202].

Aktywacja komórek T polega na prezentacji peptydów wirusowych przez główny kompleks zgodności tkankowej (MHC). Pokrótce, prezentacja antygenu przez MHC klasy I wynika z degradacji proteasomów, a otrzymane peptydy będą indukować aktywację limfocytów T CD8 plus, umożliwiając zapoczątkowanie i proliferację cytotoksycznej odpowiedzi limfocytów T. Prezentacja antygenu MHC klasy II wynika z proteolizy lizosomalnej, a powstałe peptydy indukują aktywację limfocytów T CD4 plus po prezentacji, wyzwalając późniejszą aktywację limfocytów B [203]. Obecnie dobrze scharakteryzowano, że autofagia promuje prezentację peptydu cząsteczkom MHC klasy II [204]. Nic dziwnego, że autofagia jest jednym z najstarszych mechanizmów obronnych przed infekcją i ważną częścią repertuaru komórkowego przed atakującymi patogenami, uczestnicząc zarówno we wrodzonych, jak i adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. Może bezpośrednio sekwestrować patogen do degradacji (ksenofagia) i uczestniczy w jego prezentacji układowi odpornościowemu [205–207]. Makroautofagia (częściej nazywana autofagią) jest konserwatywnym szlakiem degradacji lizosomów, który uczestniczy w wielu podstawowych procesach fizjologicznych, takich jak homeostaza oraz odporność wrodzona i nabyta [208-210]. Autofagia charakteryzuje się tworzeniem pęcherzyka z podwójną błoną zwaną „autofagosomem”, który pochłania ładunki cytoplazmatyczne (tj. organelle, agregaty i patogeny) przeznaczone do degradacji (ryc. 2). Podczas tego procesu autofagosomy zawierające ładunek łączą się z lizosomami w celu degradacji i recyklingu.

Prezentacja antygenu poprzez autofagię została opisana zarówno dla MHC klasy I, jak i klasy II [204]. Po indukcji autofagii antygeny wewnątrzkomórkowe są pochłaniane przez autofagosomy, łącząc się z przedziałami zawierającymi MHC klasy II, aby zapewnić im zewnętrzny materiał patogenny (ryc. 2) [211]. Rola autofagii w tej konkretnej prezentacji antygenu MHC klasy II została po raz pierwszy opisana dla zakażenia wirusem Epsteina-Barr, gdzie hamowanie autofagii doprowadziło do zmniejszenia aktywacji limfocytów T CD4 plus [212, 213]. Do tej pory przykłady obejmują kilka wirusów, w tym wirus opryszczki pospolitej [214], wirus grypy [215] i ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) [216] i prawdopodobnie obejmuje reklamy (patrz poniżej). Prezentacja MHC klasy II jest zgodna z procesem autofagii, ponieważ jest cytozolowym mechanizmem obronnym. Autofagia jest również zaangażowana w krzyżową prezentację antygenów pozakomórkowych MHC klasy II [214]. Rzeczywiście, prezentacja zewnątrzkomórkowej albuminy jaja kurzego przez MHC jest bardziej wydajna, gdy mechanizm autofagii (a zwłaszcza ATG5) działa, a wykazano, że pobieranie materiału zewnątrzkomórkowego obejmuje niekanoniczną formę autofagii zwaną fagocytozą związaną z LC3- ( okrążenie) [217].

Niektóre antygeny zewnątrzkomórkowe, które są obecne w niektórych LAP, mogą być eksponowane poprzez prezentację MHC klasy II [218]. Autofagia jest również w pewnym stopniu zaangażowana w prezentację MHC klasy I, chociaż zdecydowana większość epitopów jest prezentowana poprzez mechanizm ściśle zależny od transportera związanego z kompleksem przetwarzania antygenu (TAP) [219]. Prezentacja niezależna od TAP, w której pośredniczy autofagia, była jak dotąd pokazana tylko w warunkach wyczerpania TAP [219, 220]. Jeśli ten sposób prezentacji naprawdę istnieje, pozostaje kontrowersyjny [221] i jest omawiany gdzie indziej [204,222,223].

Aby zapobiec prezentacji MHC, reklamy poświęcają dużą część swojego genomu, a mianowicie region E3, aby podważyć system prezentacji MHC w komórkach [224-228]. W większości wektorów (szczepionkowych) te geny są nieobecne, a ostatnie prace sugerują, że zwiększenie prezentacji antygenu przez MHC może poprawić skuteczność szczepionki Ad [229, 230]. Autofagia odgrywa kluczową rolę w przetwarzaniu antygenów Ad do prezentacji MHC klasy II w odporności indukowanej przez Ad [108, 229].

Montespan i in. wykazali, że Ads indukują autofagię po penetracji endosomu i że wchodzące cząstki oczyszczone przez autofagię w tym procesie są skutecznie prezentowane układowi odpornościowemu [108]. Ta obserwacja jest zgodna z badaniem opublikowanym przez Kleina i in. pokazując, że w kontekście reklam onkolitycznych antygeny wirusowe dojrzewają przez zależną od JNK formę autofagii [229]. Jednak autofagia w kontekście raka odgrywa podwójną rolę. Jako strażnik homeostazy, autofagia ogranicza inicjację guza [231], podczas gdy w zaawansowanym raku autofagia działa jako proces przeżycia sprzyjający wzrostowi guza [232, 233]. Dlatego w kontekście wektorów onkolitycznych należy dokładnie ocenić cechy autofagii specyficzne dla nowotworu.

3. Adenowirusy jako wektory (szczepionkowe).

Wektoryzacja wirusa polega na wykorzystaniu jego naturalnych właściwości przy jednoczesnej minimalizacji związanego z tym ryzyka biologicznego. Pod tym względem reklamy są doskonałymi kandydatami na wektory do opracowywania szczepionek [234]. Wektory adenowirusowe są stabilne, łatwe do uzyskania wysokiego miana i mają duże zdolności klonowania. Pozwala to na wstawienie transgenu, tj. na ekspresję wybranego antygenu. Mają szerokie spektrum zakaźności i transdukują niedzielące się komórki, a ich genom jest nieintegracyjny [1]. Jak opisano powyżej, wywołują one również odpowiedź zapalną w komórkach prezentujących antygen (APC), która pełni funkcję adiuwanta w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej niezbędnej do skutecznego szczepienia [2,3,142,235,236].

Ponadto wektory pochodzące z Ad były szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych i klinicznych w celu udowodnienia ich bezpieczeństwa [237, 238]. Aby wyeliminować niepożądaną część cyklu replikacji, należy zahamować replikację wirusa, aby zapobiec lizie komórek i namnażaniu się wirusa. Rozwój wektorów adenowirusowych rozpoczął się na początku lat 90. XX wieku jako platforma dla szerokiego zakresu podejść terapeutycznych, takich jak terapia genowa, wektory onkolityczne i opracowywanie szczepionek. Większość wczesnych opracowań wektorów to zmodyfikowane wersje wirusów gatunku C.

3.1. Rozwój wektora adenowirusa, podejście pokoleniowe

Pierwszą generację wektora Ad wykonano przez usunięcie regionu E1 i E3 z genomu wirusa, w szczególności kodującego bezpośredni czynnik wczesnej transkrypcji, zapobiegający replikacji tych wektorów. Wektory te miały zdolność klonowania około 8 kb do wstawienia transgenu z sekwencjami regulatorowymi [239-241]. Wektory pierwszej generacji wytworzono w ludzkich embrionalnych komórkach nerki (HEK) stabilnie transformowanych częścią wirusowego genomu Ad5, która uzupełnia region E1 w trans [242-247]. Jedną z głównych wad tego systemu jest to, że umożliwia on rekonstytucję genomów zdolnych do replikacji po spontanicznej rekombinacji [248]. Dodatkowa delecja E3, która nie jest konieczna do produkcji wektora, zwiększa rozmiar kasety transgenu [243] i promuje lepszą odpowiedź immunologiczną [240].

Niestety, wektory Ad pierwszej generacji nie były całkowicie transkrypcyjnie obojętne i nadal wywoływały silną odpowiedź immunologiczną przeciwko wirusowym białkom kapsydu, które ulegały ekspresji na poziomach wyjściowych [141,249,250]. Ta odporność lentiwektorowa przyczyniła się do toksyczności wektora i krótkotrwałej eliminacji transdukowanych komórek [145]. Druga generacja wektorów Ad dodatkowo miała regiony E2 i E4 usunięte z genomu wektora. E2 koduje enzymy replikacyjne, a E4 dodatkowe białka regulatorowe [251–253]. Dało to miejsce na 10,5 kb sekwencji transgenu, w tym do czterech kaset ekspresyjnych [254]. Podobnie, dodatkowe delecje silnie zmniejszyły niepożądaną rekombinację i przedłużoną ekspresję transgenu [255]. Było to prawdopodobnie wynikiem zmniejszonej nieprawidłowej ekspresji genów wirusowych, która dodatkowo zmniejsza odporność przeciwwektorową [141,250,251]. Wektory adenowirusowe trzeciej generacji są koncepcyjnie różne. Składają się z opakowanego genomu wektora i nieopakowanego genomu wirusa (wirusa pomocniczego), który wytwarza cząstki wektorów. Takie wektory są również znane jako wektory „pomocnicze”, „pozbawione jelit” lub „o dużej pojemności” (HC-Ad). Mają najwyższą możliwą zdolność klonowania i mogą przenosić sekwencje do 36 kb [256-258]. Reklamy o dużej pojemności nie mają żadnych wirusowych sekwencji kodujących, z wyjątkiem ITR i krótkiego sygnału enkapsydacji, który umożliwia pakowanie genomu i którego nie ma w wirusie pomocniczym [259-262]. Ta strategia pozwoliła nam ostatecznie przezwyciężyć większość odporności przeciwwektorowej, umożliwiając długoterminową ekspresję transgenów [263-267]. Jednak reklamy HC nie należą do obecnego repertuaru wektorów szczepionek.

3.2. Adenowirus jako wektor szczepionkowy

Przed zbadaniem, w jaki sposób wektory Ad zostały wykorzystane, warto wspomnieć, że szczepienie przeciwko wirusom Ad gatunku B typu 4 i typu 7 zostało opracowane na początku lat 70. [268]. Ta doustna żywa szczepionka jest obowiązkowa od 2011 r. dla rekrutów wojskowych w USA i radykalnie zmniejszyła wskaźniki infekcji, osiągając praktycznie zero [269-271]. Podkreśliło to wewnętrzną skuteczność i bezpieczeństwo reklam jako szczepionki i otworzyło pole do wykorzystania reklam jako platformy szczepień. Do tej pory ponad 200 szczepionek opartych na reklamach weszło do badań klinicznych [272]. Wiele z nich jest skierowanych przeciwko zakaźnym patogenom, takim jak HIV{10}} i Ebola [230,273,274]. Szczepionki oparte na adenowirusach nie są pozbawione wad. Niedawno opracowana szczepionka przeciw HIV, oparta na wirusie Ad5 z gatunku C, wykorzystywała mieszaninę wektorów wyrażających geny gag, pol i nef wirusa HIV -1 [275, 276]. Wektory były bezpieczne, immunogenne i dobrze tolerowane. Niestety wynikające z tego badanie kliniczne STEP musiało zostać przedwcześnie przerwane [277–279]. Nie tylko wykazano, że ta szczepionka nie chroni przed zakażeniem HIV, ale dane epidemiologiczne sugerują, że szczepienie Ad w tym przypadku zwiększa ryzyko zakażenia HIV [280-282]. Posiadanie istniejącej wcześniej odporności przeciwko Ad5 zostało zidentyfikowane jako potencjalny czynnik ryzyka po szczepieniu [283, 284]. Jednak ta obserwacja nie została potwierdzona w podobnych badaniach [285,286] i pozostaje mechanistycznie niejasna [287,288]. Oprócz wirusa HIV, w walce z Ebolą (Ad-EBOV), powtarzającym się zagrożeniem w Afryce Zachodniej, opracowano szczepionki wektorowe oparte na reklamie [289]. Wszystkie szczepionki Ad-EBOV wykorzystują glikoproteinę wirusa Ebola (GP) jako antygen szczepionkowy. Wstępne badania przedkliniczne na gryzoniach i naczelnych wykorzystywały Ad5 i wykazały ochronę przez 3 miesiące z produkcją przeciwciał neutralizujących i aktywacją CD8 plus [273, 290–292]. Ta szczepionka przeszła badanie kliniczne fazy II; jednak istniejąca wcześniej odporność na Ad5 w szczepionej populacji doprowadziła do różnic w poziomie wywołanych przeciwciał neutralizujących [293-297]. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowano szczepionki oparte na mniej rozpowszechnionym gatunku D Ad26 [186,298,299].

Jednak Ad26 jest mniej immunogenny u ludzi, co skutkuje zmniejszoną skutecznością szczepienia i wymaga pierwotnej dawki przypominającej przy użyciu szczepionki opartej na wirusie odry (MVA). Ten schemat szczepień osiągnął III fazę badań klinicznych [289,300,301]. Trwają również prace nad wykorzystaniem wektorów Ad innych niż ludzkie [184]. Wykorzystanie ChAd3 szympansa jako platformy szczepionki przeciwko EBOV wykazało ochronę u gryzoni i szympansów [302,303], a badania kliniczne z wykorzystaniem tych wektorów są na różnym etapie zaawansowania [17,300,301,304-306].

Do niedawna szczepionki przeciwko HIV-1 i EBOV były dwoma głównymi przykładami zastosowania szczepionek opartych na wektorach Ad, ale nie są one jedynymi. Podejmowano różne próby wykorzystania wektorów szczepionki Ad przeciwko różnym patogenom, takim jak Mycobacterium tuberculosis [307–310], wirus dengi [311–313], wirusowe zapalenie wątroby typu B i C [314–320], wścieklizna [321–324] lub grypa [325-328]. Jednak ich skuteczność była zawsze poniżej oczekiwań (więcej szczegółów w [18,142,300,329]). Kandydat na szczepionkę EBOV pozostał jedyną praktycznie stosowaną szczepionką Ad i jest stosowany z pewnymi ograniczeniami w Demokratycznej Republice Konga. Ta szczepionka jest oparta na typie Ad26 (Ad26-ZEBOV/MVA-BN-FILO), a według stanu na maj 2020 r. pierwszą dawkę szczepionki otrzymało 20 339 osób, a 9560 było w pełni zaszczepionych [230 301 330].

W odpowiedzi na pandemię SARS-CoV{2}} szczepionki wektoryzowane adenowirusami zyskały dużą popularność. Pilność sytuacji umożliwiła wykorzystanie ich rozwoju, w tym doświadczenia zdobytego przy szczepionkach przeciwko koronawirusom, które spowodowały poprzednie ograniczone regionalnie epidemie SARS-CoV{4}} [331]. Glikoproteina typu spike (S) koronawirusa została zidentyfikowana jako najlepszy antygen szczepionki pod względem odporności na zakażenia koronawirusem [332, 333]. Do tej pory cztery szczepionki wektora Ad, wszystkie kodujące antygen kolca, są w zaawansowanym stanie i zostały dopuszczone do użytku awaryjnego w dużych częściach świata. Zastosowane strategie wektorowe były nieco inne, ale zasadniczo obejmują wykorzystanie wektorów pierwszej generacji. Obejmują one wykorzystanie wektorów opartych na gatunku C Ad5- (Ad5-}nCoV), pokonywanie istniejącej wcześniej odporności za pomocą dużej dawki wektora (CanSino) [187,334], aż po użycie mniej rozpowszechnionego wirusa gatunku D Ad26, z użyciem stabilizowanej glikoproteiny typu spike (JNJ-78436735/Ad26.COV2.S) [335]. Alternatywne podejście wykorzystuje ChAdOx1-S-(AZD1222), wektor Ad z szympansów [336,337]. Jedyna stosowana szczepionka oparta na heterologicznej strategii szczepienia pierwotnego i przypominającego w celu przezwyciężenia odporności na wektory (Gam-COVIDVac/Sputnik V) najpierw podaje wektor oparty na Ad{26}}, a następnie we wstrzyknięciu przypominającym wykorzystuje wektor Ad5 [338,339]. We wszystkich przypadkach dane z badań klinicznych były bardzo obiecujące, wykazując wysoki poziom indukowanej odporności ochronnej, aw kilku krajach zezwolono na awaryjne stosowanie szczepionek opartych na Ad. Ponadto badania epidemiologiczne trwających kampanii szczepień w różnych krajach wskazują na przytłaczający sukces w stosowaniu szczepionek przeciwko SARS-CoV-2 opartych na reklamach.

4. Modulowanie skuteczności wektora adenowirusa (szczepionki), kapsyd przewodzi

Projekt wektora adenowirusa (szczepionki) musi uwzględniać kilka czynników. Obejmują one utrzymywanie długiej i trwałej ekspresji zakodowanego antygenu i aktywację kontekstu immunologicznego (efekt adiuwanta), który umożliwia wydajną translację ekspresji antygenu w trwałą odporność nabytą skierowaną przeciwko immunogenowi, ale nie przeciwko samemu wektorowi. Kontekst immunologiczny zapewnia wrodzona aktywacja immunologiczna, którą wywołuje wektor szczepionki podczas podawania. W tym kontekście ważna jest skuteczność, z jaką czujniki wrodzonej odporności wykrywają wektor, a to z kolei określi amplitudę odpowiedzi adaptacyjnej. Jak opisano w powyższych sekcjach, wrodzone wykrywanie odporności ma miejsce głównie na poziomie po wejściu, równolegle z penetracją endosomu Ad. Skuteczna ekspresja antygenu (szczepionkowego) zależy zatem od równowagi między poziomem klirensu wektora a pomyślnym dostarczeniem i ekspresją genomów wektora do jądra. Wraz z rozwojem wektorów prezentujących kapsyd, ekspresja transgenu nie jest wymagana do wywołania aktywacji immunologicznej. Ta strategia opiera się na wstawieniu epitopu będącego przedmiotem zainteresowania do białek kapsydu Ad, umożliwiając jego bezpośrednią ekspozycję na układ odpornościowy. Nawet jeśli to podejście ma pewne zalety, większość wektorów szczepionek opiera się na genetycznie zakodowanych genach. Więcej informacji na temat wektorów wyświetlania kapsydu można znaleźć w tych recenzjach, [340,341].

Istniejąca wcześniej odporność przeciwko wektorowi wirusowemu (np. 30–90% przeciwko wirusowi gatunku C Ad5, w zależności od położenia geograficznego) może zmniejszyć wychwyt wektora i zmniejszyć ekspresję antygenu oraz wynikającą z tego odpowiedź immunologiczną [342–344]. Opracowano kilka strategii zmniejszania odporności przeciwwektorowej, które ostatnio zostały poddane przeglądowi [249]. Krótko mówiąc, przeciwciała neutralizujące rozpoznają głównie hiperzmienną pętlę egzonów iw konsekwencji są specyficzne dla serotypu [178-180]. Te hiperzmienne pętle można zatem zastąpić pętlami innego, mniej rozpowszechnionego serotypu [178, 345]. Zapobiega to neutralizacji i inaktywacji wektora. Ponieważ Ad5 jest typem seropowszechnym, użycie rzadkich serotypów, takich jak Ad26, Ad35 lub innych niż ludzkie Ads, również pozwoliłoby uniknąć tego problemu [177,346–350].

Jednak główną wadą stosowania rzadkich typów jest ich niższa immunogenność, co czyni je mniej skutecznymi w opracowywaniu szczepionek [298]. Dlatego strategie zmniejszania odporności przeciwwektorowej powinny być opracowywane równolegle ze strategiami zwiększania immunogenności wektora w celu uzyskania najbardziej wydajnego wektora. Nawet jeśli początkowy poziom przeciwciał neutralizujących przeciwko wektorowi jest niski, szczepienie danym typem wektora może wywołać reakcję uniemożliwiającą jego użycie w przyszłości. Torowanie odpowiedzi przeciwwektorowej ma miejsce również na poziomie post-entry, kiedy cząstki wektorów są sortowane i przetwarzane jako same antygeny. Wywołanie immunologicznie korzystnego kontekstu dla sukcesu szczepienia może nastąpić kosztem zwiększonej odporności na wektory. Zrozumienie parametrów, które decydują o losie wektorów Ad po wchłonięciu, może być okazją do projektowania wektorów.

4.1. Stabilność leży w gatunku

Wychwyt za pośrednictwem receptora i ucieczka z przedziału endo-lizosomalnego są cechami charakterystycznymi infekcji Ad i transdukcji wektora. Początkowy wychwyt zależy od interakcji włókna wirusowego i cząsteczek pentonu z receptorami komórkowymi. Włókno i penton są wspólne dla wszystkich reklam, ale w zależności od ich gatunku angażują się w różne receptory komórkowe (Tabela 1). Wirusy z gatunku C wykorzystują CAR, a wchodzące cząsteczki wydostają się z wczesnego przedziału endosomalnego [79]. Jeśli wirusy gatunku C (Ad5) są zaprojektowane tak, aby zawierały cząsteczkę błonnika z wirusa gatunku B (Ad16), powstała cząstka (Ad5F16) następnie ucieka z przedziału lizosomalnego (jak pokazano przez barwienie markerem lizosomalnym LAMP1) zamiast wczesnego endosom [351]. Ta opóźniona ucieczka z lizosomów jest cechą wspólną wszystkich testowanych wirusów gatunku B [111,352,353].

Ponadto wirusy hybrydowe Ad5F16 oraz wirusy z gatunku B wywołują silniejszą odpowiedź prozapalną niż wirusy z gatunku C [159, 351]. Przypisuje się to zwiększonemu wykrywaniu przez TLR9 wewnątrz światła w komórkach odpornościowych [354]. Ponadto uszkodzenie błony lizosomalnej, w przeciwieństwie do wczesnego uszkodzenia endosomu, powoduje silny stres oksydacyjny. Pęknięcie lizosomu współuwalnia hydrolazy lizosomalne, takie jak katepsyna B, które mogą uszkadzać mitochondria, wzmacniając w ten sposób odpowiedź na uszkodzenie poprzez aktywację inflamasomu [355-357]. Proces wychwytu Ad destabilizuje kapsyd, umożliwiając uwolnienie wirusowego białka VI [103,106]. Uwolnione białko VI przenika następnie przez błonę z przedziału endo-lizosomalnego, aby umożliwić wirusowi dostęp do cytozolu. Porównanie gatunków C i B pokazuje, że oba wirusy są równie skuteczne we wchodzeniu do cytozolu i dostarczaniu genomu, ale różnią się kinetyką ucieczki [111]. Niezwykły jest fakt, że prosta zamiana włókien może przenieść właściwości wejściowe i immunogenne z wirusa gatunku B na gatunek C. Zapewnia dowód koncepcji, że można zaprojektować wektory hybrydowe o określonych właściwościach. Wydaje się, że podstawowa różnica polega na tym, że uwalnianie białka VI jest opóźnione w wirusach gatunku B (lub wirusie hybrydowym) i może wymagać albo zakwaszenia, albo innego, nieznanego wyzwalacza demontażu.

Ponieważ w tym przypadku uwalnianie białka VI jest opóźnione, może to odzwierciedlać zwiększoną stabilność kapsydu. Rzeczywiście, wykazano, że wirusy Ad5 gatunku C uwalniają cząsteczkę błonnika po związaniu się z komórką, co zakłada osłabienie kapsydu i przygotowanie procesu demontażu do uwolnienia białka VI. W tym kontekście wykazano, że bezwłóknisty Ad5 jest mniej stabilny niż cząstki natywne [358]. W przeciwieństwie do tego, niedojrzałe, bardzo stabilne Ts1 Ad2/5 nie uwalniają błonnika ani białka VI i są słabymi induktorami zapalenia, ponieważ nie wyzwalają TLR9 ani nie powodują uszkodzenia błon [114,138,359,360].

To, czy zamiana włókien na gatunek B zapobiega początkowemu uwalnianiu włókien i czyni kapsyd gatunku C bardziej stabilnym, nie zostało zbadane, ale jest prawdopodobne. Stabilność kapsydu może być istotnym wyznacznikiem losu kapsydu po wejściu, a co za tym idzie, cechą, którą można wykorzystać do projektowania wektorów. Wirusy gatunku B mogą być bardziej stabilne dzięki zastosowaniu innego receptora lub dzięki unikalnej interakcji włókno-penton. W przeciwieństwie do tego, wirusy z gatunku F Ad40/41 infekują przewód pokarmowy i mają zwiększoną stabilność kapsydu ze względu na ich tropizm i adaptację do trudnych warunków jelitowych [24, 361]. Jelito ma wewnętrzną temperaturę, która jest kilka stopni wyższa niż górne drogi oddechowe, na które atakują wirusy z gatunku C (37°C vs. 33°C) [362]. Zatem Ad40/41 są z natury bardziej termostabilne, wspierając proces infekcji [24], co również utrudnia ich propagację [24,361,363].

Ponadto brakuje im motywu RGD w cząsteczce pentonu, co powoduje dalsze zmniejszenie wejścia do komórki [92]. Nie wiadomo, czy te unikalne właściwości kapsydu przekładają się na ucieczkę z przedziału lizosomalnego lub częściowy demontaż/uwalnianie białka VI po wejściu. W przeciwieństwie do tego właściwości te mogą stanowić kontekst dla rozwoju zastosowań szczepionek doustnych. W przeciwieństwie do włókien gatunku B, wektory zawierające włókna gatunku F mają zmniejszoną aktywację immunologiczną [364] po zastosowaniu w standardowych warunkach środowiskowych. Jeśli dany ludzki gatunek Ad zostanie teraz wyjęty z kontekstu i wykorzystany jako wektor szczepionki, warto przyjrzeć się naturalnemu tropizmowi tego wektora, aby znaleźć wskazówki do przewidywania jego zachowania. Obecnie stosowanym wektorem szczepionkowym opartym na Ad26 jest wirus gatunku D, a jego naturalnym tropizmem są oczy i przewód pokarmowy [365]. Wirusy z gatunku D, w tym Ad26, są mniej immunogenne niż Ad5 [366] i wykazano, że przemieszczają się do późnego przedziału endosomalnego, prawdopodobnie z udziałem opóźnionego uwalniania białka VI.

W konsekwencji zablokowanie zakwaszenia późnego kompartmentu endosomalnego dodatkowo obniżyło jego immunogenność [113]. W przeciwieństwie do reklam ludzkich, wiedza o reklamach innych niż ludzkie, wykorzystywanych również w szczepieniach i wektoryzacji, jest bardzo ograniczona. Reklamy pochodzące od szympansów, w tym ChAd3, są blisko spokrewnione z wirusami gatunku D [367,368]. Co ciekawe, wektory Ad5 są bardziej immunogenne niż wektory Ad pochodzące od szympansów i mają wyższy potencjał transdukcji. Ta obserwacja nie była powiązana z różnicami w motywie pentona RGD lub włóknie, a jej mechanistyczne przyczyny pozostają nieznane [369]. Nie badano potencjalnych różnic w stabilności kapsydu. Inną reklamą niebędącą człowiekiem wykorzystywaną jako wektor jest psia reklama typu 2 (CAV{11}}). Ten wektor ma niezwykłą właściwość selektywnej transdukcji neuronów, ale nie otaczających komórek glejowych, w przeciwieństwie do wektora kontrolnego Ad5, mimo że oba wektory wykorzystują ten sam receptor [370-372]. Ta zdolność może być powiązana ze zwiększoną stabilnością kapsydu, pozwalającą na odkrycie powłoki tylko w komórkach nerwowych. Psy mają temperaturę ciała o około 2°C wyższą niż ludzie, co potencjalnie skutkuje podwyższoną stabilnością kapsydu CAV{16}} [373], analogicznie do wirusów z gatunku F. CAV{18}} słabo wywołuje wrodzoną odpowiedź immunologiczną, co jest zgodne z brakiem skutecznego rozkładu w komórkach docelowych [372]. Zatem wektory CAV2 mogą być kolejnym przykładem, w którym właściwość biofizyczna powiązana z ich naturalnym tropizmem lub żywicielem może potencjalnie zapewnić nowe właściwości wektora.

4.2. Dostrajanie struktury kapsydu, przykład białka VI w gatunku C Ad2/5

Jeśli stabilność kapsydu i uwalnianie białka VI determinują dalsze losy kapsydu wirusowego, powstaje pytanie, czy można to zmodyfikować w wektorach Ad, tj. przypisać wektorom wirusowym nowe właściwości (ryc. 3). Większość naszej wiedzy na temat tego, jak reklamy przenikają do przedziału endo-lizosomalnego, pochodzi z wirusów typu C Ad2/5. Odkrycie białka VI jako błonowego czynnika litycznego było niezbędne do zrozumienia tego procesu [103,106]. Białko VI koduje N-końcową amfipatyczną helisę, która jest właściwą lityczną częścią błonową białka. Podczas produkcji wirusa białko VI ulega ekspresji jako białko prekursorowe, które wiąże się z trimerami heksonu poprzez amfipatyczną helisę [42, 374]. Kompleks jest importowany do jądra poprzez sygnały transportowe zakodowane na N- i C-końcu białka VI, które są usuwane podczas składania i dojrzewania wirusa przez wirusową proteazę. C-końcowy 11-aminokwasowy peptyd również aktywuje proteazę, zapewniając inteligentny sposób łączenia składania wirusa z osłoną amfipatycznej helisy. Zmutowany wirus Ts1 Ad2/5 ma defekt upakowania proteazy i żadne z białek kapsydu, w tym białko VI, nie jest przetwarzane. Powstałe cząstki są hiperstabilne, zachowują włókna i nie rozkładają białka VI.

W konsekwencji cząstki Ts1 są sortowane do lizosomów po endocytozie, w której pośredniczy receptor. Dokładna lokalizacja białka VI w dojrzałym wirusie nie jest jasna, ale rozszczepiony koniec N znajduje się na wewnętrznej powierzchni heksonu eksonów okołoosobowych [37,104,375]. Wykazano, że dwie mutacje punktowe w białku VI, G33A i S28C zwiększają stabilność kapsydu Ad5 (ryc. 3A) [376, 377]. Pierwszy mutant poprzedza N-końcowe miejsce cięcia proteazy w białku VI i upośledza przetwarzanie. Powstałe cząstki są częściowo niedojrzałe i charakteryzują się defektem lizy endosomu, co sugeruje, że N-koniec białka VI stabilizuje interakcje białko-białko wewnątrz wirionu [376]. Drugi mutant został wybrany ze względu na jego zdolność do tworzenia wewnątrzcząsteczkowych mostków dwusiarczkowych [377].

Wirus zawierał częściowo nieprzetworzone białka, potencjalnie zawierające białko VII, ale nieoczekiwanie nie wykazywał żadnych defektów zakaźności, pomimo zwiększonej stabilności. Nie wiadomo, czy którykolwiek z wirusów ma zmieniony profil aktywacji immunologicznej. Inną mutacją punktową w białku VI, która wpływa na losy wirusa, jest mutacja L40Q białka VI, zlokalizowana bezpośrednio w helisie amfipatycznej (ryc. 3A) [378, 379]. Wirusy z tą mutacją dojrzewają normalnie, ale są częściowo niezdolne do etapu lizy endosomu. W przeciwieństwie do wyżej wymienionych mutantów, wiriony L40Q są mniej stabilne niż ich odpowiedniki typu dzikiego. Zamiast opóźnienia, białko VI oraz penton są uwalniane przedwcześnie z kapsydu L40Q. Wiriony L40Q są mniej zakaźne i podlegają częściowemu sortowaniu lizosomów. Jednak mutacja L40Q nie znosi całkowicie lizy błony, a niektóre wirusy przedostają się do cytosolu, co skutkuje czterokrotnie zmniejszoną zakaźnością wektora L40Q [379, 380]. Obserwacje sugerują, że amfipatyczna helisa przyczynia się poprzez swoje oddziaływanie do stabilności cząstek. Nie wiadomo, czy iw jaki sposób mutacja L40Q zmienia właściwości immunogenne wektorów Ad5. Ostatnie obserwacje sugerują, że uwalnianie białka VI z kapsydu jest wyzwalane przez wewnętrzną rywalizację z białkiem VII o te same lub nakładające się miejsca wiązania w eksonach [375].

Konsekwentnie, zmutowany wirus pozbawiony białka VII nie może uciec z endosomu i ma defekt w lizie endosomu [58]. Dalsze zrozumienie strukturalnej i dynamicznej organizacji kapsydu wewnętrznego (tj. białka VI) i białek rdzeniowych (tj. białka V i VII) w cząstce iw trakcie wpisu w komórce znacznie pomoże zrozumieć, co determinuje (odwracalną) stabilność kapsydu.

Kontrolowanie skuteczności aktywacji immunologicznej wektorów Ad jest głównym przedmiotem zainteresowania przy opracowywaniu szczepionek, a rozszerzenie prezentacji antygenów przez MHC poprawiłoby rozwój szczepionek [381]. Jak wspomniano wcześniej, autofagia reguluje aktywację immunologiczną i dostarcza peptydy do MHC. Autofagia jest jednym z najstarszych komórkowych mechanizmów obronnych przed infekcją, jednak Ads, jako przystosowane ludzkie patogeny, nie wyewoluowały mechanizmów pozwalających uniknąć autofagii po wejściu. Zamiast tego wydaje się, że obejmują aktywację autofagii i przenoszą odpowiedzialność na promowanie infekcji. Białko VI odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu odpowiedzi autofagii komórki. Liza błony adenowirusa przez białko VI prowadzi do rekrutacji galektyny 3 i galektyny 8, które są rozpoznawane przez komórkę jako sygnały ostrzegawcze (ryc. 3B) [108,109,382]. Wykrywanie miejsc penetracji Ad przez galektyny aktywuje selektywną autofagię w zakażonej komórce, co ilustruje rekrutacja receptorów autofagii (np. NDP52 i p62) oraz tworzenie punkcików LC3 [108].

Co ciekawe, cząsteczkom wektorów Ad5 udaje się uciec z pękniętego endosomu i mogą przemieszczać się do jądra. Hamowanie autofagii nie wpływa na zakaźność wirusów, ale opóźnia dostarczanie ich genomu do jądra, co pokazuje, że reklamy przejmują maszynerię komórkową dla własnego zysku [108]. Ucieczka z endosomu pozwala zatem wirusowi uniknąć degradacji przez autofagię w aktywnym procesie. Proces ten został odkryty przez jeszcze jednego mutanta białka VI, mutanta M1. Wszystkie reklamy ludzkie (i kilka reklam innych niż ludzkie) kodują wysoce konserwatywny motyw peptydowy PPxY w białku VI. W mutancie M1 motyw ten został zmieniony na PGAA (ryc. 3) [104]. Zarówno typ dziki, jak i mutant M1 skutecznie uwalniają białko VI po wejściu i wyzwalają autofagię po pęknięciu błony endosomalnej. Jednak zmutowany wirus M1 nie jest w stanie skutecznie uciec do cytozolu, a obrazy EM pokazały, że zmutowane wirusy M1 są uwięzione w pękniętych endosomach, na cel autofagii.

W konsekwencji wykazano, że zmutowany wirus M1 ma silny defekt zakaźności, który jest przywracany po farmakologicznym i genetycznym hamowaniu autofagii. Badanie wykazało, że wirusy typu dzikiego wykorzystują swój motyw PPxY do rekrutowania ligazy ubikwitynowej NEDD4.2 i ograniczania dojrzewania autofagosomów na tyle długo, aby mogły uciec do cytozolu. Ponadto ta właściwość umożliwia wirusowi ograniczenie prezentacji antygenowej [108]. Co ważne, zmutowany wektor M1 wstrzyknięty myszom spowodował znacznie silniejszą odporność przeciwwektorową i zmniejszoną odpowiedź CD8 plus na kodowany transgen, co pokazuje, że prosta zmiana kapsydu może mieć głęboki wpływ na immunogenność kapsydu Ad5. Nie wiadomo, czy jakakolwiek inna mutacja białka VI wpływa na immunogenność. Jednak obecność motywu PPxY w wirusie L40Q może wyjaśniać, dlaczego wektor zachowuje stosunkowo wysoką infekcyjność pomimo defektu lizy błony [379, 380]. Ponieważ liza endosomu jest mniej wydajna, a wektory L40Q trafiają częściowo do przedziału lizosomalnego, można sobie wyobrazić, że wywołana odpowiedź immunologiczna różni się jeszcze od kapsydów typu dzikiego, Ts1 lub M1 Ad5.