Jaka jest różnica między dziko rosnącą cistanche a sztucznie hodowaną cistanche w aktywności wzmacniającej odporność

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Zhao Bing; Yang Xiumei; Wu Daocheng; Ba Xueli; Li Quanxiao; Tan Yachao; Zhang Ailian

Abstrakcyjny:

Cel:Porównanie efektów wzmocnienia odporności dziko rosnących cistanche i sztucznie hodowanych polisacharydów cistanche z cistanche (dalej: odpowiednio WCDPS i CCDPS).

Metody:Różne dawki (niskie, średnie i wysokie) WCDPS i CCDPS oraz albuminy jaja kurzego (OVA) immunizowano podskórnie myszami ICR, przeciwciałami specyficznymi dla OVA IgG i podtypami przeciwciał IgG1 i IgG2a wykrywano metodą ELISA i metodą MTT. Aktywność proliferacji limfocytów swoista dla OVA, cytometria przepływowa do wykrywania poziomu ekspresji limfocytów T CD4 plus i limfocytów T CD8 plus.

Wyniki:Zarówno WCDPS, jak i CCDPS mogą znacząco zwiększyć poziomy ekspresji przeciwciała IgG specyficznego dla OVA i typowania przeciwciał IgG1 i IgG2a (P<0.05), and="" there="" is="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" same="" doses="" of="" wcdps="" and="" ccdps="" (f="">0. 05); WCDPS and CCDPS can significantly promote OVA-specific lymphocyte proliferation, and the difference between the same dose is not statistically significant (P>0.05); WCDPS i CCDPS mogą również znacznie zwiększyć odsetek sub-zawartości limfocytów T CD4 plus T i CD8 plus (P<0.05), and="" the="" difference="" between="" the="" same="" dose="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), WCDPS i CCDPS nie miały wpływu na wagę immunizowanych myszy.

Wniosek:Zarówno WCDSP, jak i CCDPS mogą znacząco wzmocnić humoralną i komórkową odpowiedź immunologiczną specyficzną dla OVA i nie ma między nimi istotnej statystycznie różnicy i są one bezpieczne.

Słowa kluczowe: cistanche; polisacharydy z cistanche; albumina jaja kurzego; adiuwant

Cistanche (C. deserticola. YC Ma),znany również jako Cunyun i Dayun, jest pasożytniczą rośliną zielną Lydanaceae od wielu lat. Jest to rzadki i cenny chiński materiał leczniczy. Jego główne składniki obejmują polisacharydy z cistanche, związki glikozydów fenyloetanoidowych Cistanche, kwasy organiczne, alkaloidy itp.⑷, mają wiele funkcji, takich jak esencja odżywcza i krew, wspomaganie yang i tonizowanie nerek oraz łagodzenie starzenia⑸. Ze względu na niezwykle wysoką wartość leczniczą cistanche, nadmierna eksploatacja dzikich gatunków jest na skraju wyginięcia, a sztucznie uprawiana cistanche odniosła sukces. Naukowcy w kraju i za granicą przeprowadzili wiele badań nad składnikami chemicznymi i składnikami aktywnymi dziko rosnącej cistanche i sztucznie hodowanej cistanche, ale niewiele jest doniesień o porównaniu aktywności adiuwantów dzikich i uprawnych cistanche polisacharydów z cistanche (WCDPS/CCDPS) . Wiele badań wykazało, że polisacharydy roślinne z cistanche jako adiuwant mogą regulować odpowiedź immunologiczną organizmu. Wielu badaczy zastosowało chińską medycynę jako adiuwant szczepionkowy i poczyniło znaczne postępy”.

Niniejsze badanie opiera się na poprzednich badaniach (6) w celu porównaniawzmocnienie odpornościdziałalność Xinjiang WCDPS i CCDPS. Głównie poprzez eksperymenty z immunizacją myszy, różne dawki WCDPS i CCDPS immunizowano podskórnie OVA u myszy ICR i ich wpływ na poziom humoralnejodpornośći testowano odporność komórkową indukowaną przez OVA po immunizacji. Porównywaćdziko rosną cistancheorazsztucznie uprawiana cistanchepolisacharydy Aktywność polisacharydów w cytrusach wzmacniająca odporność może stanowić punkt odniesienia dla lepszego rozwoju i wykorzystania sztucznie hodowanych cistanche w Sinciangu.

Materiały i metody

Materiały eksperymentalne:

Dziko rosną cistanche i cistanche uprawne (dostępne w handlu). Pożywkę hodowlaną RPMI 1640 zakupiono od GIBCO; Surowicę płodową bydlęcą zakupiono z Israel Bioind; Przeciwciała do cytometrii przepływowej: PE szczurzy anty-mysie CD3, APC szczurzy anty-mysi CD4, FITC szczurzy-anty mysi CD8a zakupiono od amerykańskiej firmy BD, białko jaja (Ovalbumin, OVA) Sigma produkt, kozie anty-mysie znakowane nadtlenkiem chrzanu IgG, IgG1 i IgG2a zakupiono w Southbiotech, USA. Pozostałe eksperymentalne odczynniki chemiczne to wszystkie domowe odczynniki analityczne.

Zwierzęta doświadczalne:

Samice myszy ICR czystej klasy (6-8 tygodnie, 18-22 g) zakupiono z Doświadczalnego Centrum Zwierząt Uniwersytetu Medycznego Xinjiang. Zwierzęta trzymano w pokoju dla zwierząt naszego laboratorium, a eksperyment rozpoczęto 7 dni po aklimatyzacji zwierząt.

Przygotowanie WCDPS i CCDPS:

W pracy [17] zastosowano metodę ekstrakcji wodnej i strącania alkoholem. Krótkie kroki są następujące: Weź suchy proszek z upraw Xinjiang i dzikiego cistanche, dodaj 10-krotną objętość wazeliny i absolutnego etanolu do ultradźwięków przez 1 godzinę; po filtracji próżniowej zachować pozostałość leku i wysuszyć, dodać 10-krotną objętość wody destylowanej 37T Ultradźwięki dwukrotnie, odwirować przy 4 000 obr/min przez 10 min, połączyć supernatanty, odparować na wyparce obrotowej i zatężyć i wytrącić przez noc za pomocą alkohol; po filtracji próżniowej i wysuszeniu otrzymuje się surowy ekstrakt w proszku; Metoda Savage ⑻ usuwa białko z WCDPS i CCDPS. Zawartość polisacharydów z cistanche w WCDPS i CCDPS oznaczona metodą cebulowo-siarkową wyniosła odpowiednio 76,82 proc. i 59,58 proc.

Immunizacja myszy i pobieranie surowicy:

Jako doświadczalne modele zwierzęce wykorzystano {{0}}-tygodniowe samice myszy ICR. Doświadczenie podzielono na 9 grup, po 5 w każdej grupie: 0,9 procent NaCl, OVA 10 jig, OVA-Alum 200 |jLg, OVA-WCDPS 10 |xg, OVA-WCDPS 50 |xg, OVA- WCDPS 100 netto, OVA-CCDPS 10 |jLg, OVA-CCDPS 50 |xg, OVA-CCDPS 100 netto. Rozpuścić w 0,9% NaCl przed immunizacją i immunizować myszy podskórnie dwukrotnie w odstępie 2 tygodni. Krew jest pobierana przed immunizacją, a surowica-80Y jest przygotowywana i przechowywana do późniejszego użycia.

Wpływ WCDPS i CCDPS na wzrost myszy:

Aby zaobserwować wpływ WCDPS i CCDPS na wzrost myszy, masy myszy w każdej grupie zważono 0 dnia przed wstępną immunizacją, 14 dnia i 21 dnia po immunizacji.

Wykrywanie przeciwciał IgG w surowicy myszy i typowanie po immunizacji WCDPS i CCDPS:

Do oznaczenia przeciwciał w surowicy zastosowano pośrednią metodę ELISA. Płytkę ELISA powlekano 2,5 μg/ml OVA, 4 lata przez noc; przemyto 3 razy PBST, a następnie dodano 5 procent odtłuszczonego mleka w proszku 37 l w celu zablokowania przez 1 godzinę; przemyte 3 razy PBST i dodane do myszy pierwszorzędowe przeciwciało po immunizacji w każdej grupie Surowica, stosunek rozcieńczenia pierwszorzędowego przeciwciała wynosi 1:100, 100 pigułek na studzienkę, 37 μl godz.; po 3 przemyciu PBST dodać przeciwciała drugorzędowe: kozie anty-mysie IgG, IgG1, IgG2a (l: 5 000) znakowane HRP 37 Inkubować smoka przez 1 godz.; po 4-krotnym przemyciu PBST, dodać roztwór substratu tetrametylobenzydyny (TMB), aby uniknąć światła przez 15 min. Dodaj 50 do każdego dołka, aby zatrzymać reakcję z 2 mol/L H2SO4 i zmierz wartość A45O/655. Porównaj poziomy przeciwciał w każdej grupie.

Wykrywanie proliferacji limfocytów śledziony myszy po immunizacji WCDPS i CCDPS:

Metodę MTT zastosowano do wykrycia proliferacji limfocytów w śledzionie myszy immunizowanych CCDPS i WCDPS. Śledzionę myszy izolowano w warunkach aseptycznych 21 dni po początkowej immunizacji, a komórki śledziony rozcieńczano 10 procentem pożywki RPMI 1640 zawierającej FBS w celu uzyskania pojedynczych komórek Zawiesina, zliczenie i dostosowanie komórek komórek/ml rozprowadzić na 96-studzienkowej płytce do hodowli komórkowej, dodać odpowiednio 20 OVA (stężenie końcowe 10 |xg/ml) i ConA (stężenie końcowe 5 μg/ml) Stymulować, ustawić pustą kontrolę komórkową i pustą surowicę w tym samym czasie, umieścić go w inkubatorze komórek 37Y na 48 godzin, dodać 20 MTT do każdego dołka, 37^ i kontynuować inkubację przez 4 godziny, dodać 100|±1 DMSO do każdego dołka w celu rozpuszczenia i przetestować serce 0 /63.Wartość, obliczyć wskaźnik stymulacji (SI) każdej grupy myszy.

Ekspresja CD4 i CD8 na limfocytach T CD3 plus po immunizacji WCDPS i CCDPS:

Cytometrię przepływową zastosowano do wykrycia ekspresji limfocytów T CD4 plus i CD8*T na powierzchni limfocytów T CD3 plus. Śledzionę myszy izolowano w warunkach aseptycznych 21 dni po pierwotnej immunizacji i śledzionę traktowano pożywką RPMI 1640 zawierającą 10% FBS. Przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek, policz i dostosuj liczbę komórek do 1x106 komórek/próbkę, wykonaj barwienie CD4 i CD8 na powierzchni limfocytów T CD3 plus, chroń przed światłem w temperaturze pokojowej przez 25 min i użyj 10 ml roztwór buforowany fosforanami zawierający 0,5% FBS (roztwór buforowany fosforanami). sól fizjologiczna, PBS) 1 200 obr/min 7 min przemyć raz, dodać 250 μl PBS, przepuścić 200 mesh z miedzi, cytometria przepływowa w celu wykrycia ekspresji CD4 i CD8 na powierzchni komórek CD3*T.

Metody statystyczne:

Oprogramowanie Flowjo 7.6 przetwarza wyniki testów cytometrii przepływowej; GraphPad Prism 5.0 służy do analizy danych, a wszystkie dane są oparte na średniej ± odchylenie standardowe. Użyj Studenta i testuj, aby porównać dane między grupami eksperymentalnymi. P<0.05 means="" that="" there="" is="" a="" difference.="" statistical="">

Wynik

1. The effect of WCDPS and CCDPS on the growth of mice: After co-immunization with WCDPS and CCDPS and OVA, weigh the weight of the mice (Table 1). There was no statistically significant difference in the bodyweight of mice in each group during the same growth period ( P>0.05).

2. Wpływ WCDPS i CCDPS na przeciwciało IgG specyficzne wobec OVA: WCDPS i CCDPS immunizowano podskórnie OVA w celu wykrycia ekspresji przeciwciała IgG specyficznego wobec OVA w surowicy po 14 dniach i 21 dniach immunizacji. Wyniki przedstawiono na Figurze 1, WCDPS i CCDPS promowały ekspresję przeciwciała IgG w surowicy w sposób zależny od dawki; OVA plus WCDPS 50 p,g w porównaniu z OVA plus CCDPS 50 |xg może znacząco promować przeciwciała specyficzne dla OVA w porównaniu z OVA plus CCDPS 50 |xg. Ekspresja IgG (F<0.05), but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" compared="" with="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" (p="">0.05); the difference between WCDPS and CCDPS at the same dose was not statistically significant (P>0.05).

3. Wpływ WCDPS i CCDPS na typowanie przeciwciał swoistych dla OVA: 21 dni po immunizacji wykryto ekspresję przeciwciała swoistego dla OVA typującego IgG1 i IgG2a w surowicy. Wyniki przedstawiono na rycinie 2. OVA-WCDPS 50 jig i OVA-WCDPS 100 |xg Mumu istotnie promowały ekspresję przeciwciała IgG2a w surowicy niż sama grupa OVA (P<0.05); both="" ova-wcdps="" 50="" and="" ova-ccdps="" 50="" pigs="" could="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" ova-specific="" antibody="" iggl=""><0. 001);="" compared="" with="" ova-wcdps="" 50="" p,g,="" and="" ova-wcdps="" 100="" jig,="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" antibody="" igg2a=""><0.05); the="" expression="" of="" antibody="" typing="" is="" different="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" at="" the="" same="" dose="" no="" statistical="" significance="" (p="">0.05).

4. Wpływ WCDPS i CCDPS na proliferację mysich limfocytów OVA: W celu wykrycia wpływu WCDPS i CCDPS na limfocyty śledziony, polisacharydy z cistanche immunizowano podskórnie OVA, a komórki śledziony oddzielono 21 dni po immunizacji , a do ich wykrywania zastosowano metodę MTT Promowanie proliferacji limfocytów swoistej dla OVA. Wyniki przedstawiono na Figurze 3. WCDPS i CCDPS wzmocniona proliferacją limfocytów specyficzną dla OVA w sposób zależny od dawki. Połączenie WCDPS i CCDPS z grupą OVA może znacząco promować proliferację limfocytów specyficzną dla OVA w porównaniu z samą grupą OVA. Proliferacja limfocytów (P<0.05); ova-wcdps="" 50="" jig="" and="" ova-ccdps="" 50="" |xg="" compared="" with="" an="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" ova-specific="" lymphocyte="" proliferation=""><0.05); the="" same="" dose="" of="" wcdps="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" ccdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05).

5. Wpływ WCDPS i CCDPS na limfocyty T CD3 plus CD4 plus i CD3 plus CD8 plus: 21 dni po podskórnej immunizacji WCDPS i CCDPS OVA, ekspresję CD4 i CD8 w limfocytach T CD3 plus wykryto metodą cytometrii przepływowej , jak pokazano na Figurze 4A Pokazano, że OVA-WCDPS 50, OVA-CCDPS 50 jig i OVA-WCDPS 100 mogą znacząco promować proliferację limfocytów T CD3 plus CD4 plus (P<0.05); as="" shown="" in="" figure="" 4b,="" ova-wcdps="" 10="" a,="" ova-wcdps="" 50="" zhao="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.05), ova-wcdps="" 100="" |xg,="" ova-ccdps="" 100="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.01); but="" the="" same="" dose="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05); there was no significant difference between WCDPS and CCDPS and OVA compared with an aluminum adjuvant group (P>0.05).

Dyskusja

Liczne badania wykazały, że chińskie ziołolecznictwo ma funkcję immunomodulacyjną „Da], a także istnieje duża liczba doniesień dowodzących, że polisacharydy chińskiego ziołolecznictwa z cistanche mogą być stosowane jako adiuwant wzmacniający działanie immunologiczne szczepionek”3], oraz wybrane w tym badaniu mięso pustyni Xinjiang z Congrong jest unikalnym materiałem leczniczym w Sinciang, a dzikie gatunki są na skraju wyginięcia, w połączeniu z ich wyższą wartością leczniczą, uprawa gatunków uprawnych jest szczególnie ważna dla rozwoju i wykorzystania zasobów roślin leczniczych . Nowe szczepionki na obecnym rynku mają dobrą specyficzność antygenową, ale słabą immunogenność. Polisacharydy roślinne z cistanche mogą uzupełnić ten niedobór. mój kraj ma wielką przewagę w badaniach nad chińską ziołolecznictwem. Badamy adiuwanty szczepionkowe z naturalnych chińskich leków ziołowych. Wysoka wykonalność. Badania wykazały, że chińskie polisacharydy ziołowe z cistanche mają różny stopień regulacji odporności swoistej i nieswoistej, takie jak polisacharydy Ganoderma z cistanche, polisacharydy Radixisatidis z cistanche, polisacharydy Poria cocos z cistanche koji, polisacharydy inuliny z cistanche 27] itp. Może wzmocnić działanie immunologiczne szczepionki.

Ze względu na szybki wzrost popytu na cistanche, jego dzikie gatunki zostały wydobyte i są obecnie wymienione jako rośliny zagrożone i chronione w moim kraju. W oparciu o sukces sztucznego sadzenia pustynnego Caulis Carlsbad oczekuje się, że gatunki uprawne zastąpią gatunki dzikie. W tym eksperymencie dziko hodowane cistanche i hodowane sztucznie hodowane polisacharydy cistanche zastosowano jako adiuwanty OVA do przeprowadzenia eksperymentów immunizacji myszy in vivo. Testując różne wskaźniki, wstępnie oceniono wpływ odpornościowy dzikiej i uprawnej cistanche, co stanowiło odniesienie do efektywnego wykorzystania cistanche z upraw w Xinjiangu.

Aby zrozumieć bezpieczeństwo dziko rosnących cistanche i uprawianych sztucznie uprawianychcukry cistanchez cistanche, eksperymenty immunizacji zwierząt in vivo zaobserwowały cechy charakterystyczne wyglądu myszy i wykazały, że myszy nie mają biegunki, wzniesionych włosów ani łez po immunizacji, a ich aktywność i oddychanie są normalne i nie ma drgania mięśni. Nie było znaczącej różnicy w masie ciała myszy w każdej grupie z powodu zjawiska zaburzenia, co wskazuje, że immunizacja WCDPS i CCDPS nie wpłynęła na wzrost myszy i miała pewien stopień bezpieczeństwa. Przeciwciała IgG i wyniki testu typowania pokazują: WCDPS i CCDPS mogą znacząco zwiększyć ekspresję przeciwciała IgG swoistego dla OVA po koimmunizacji OVA, a efekt jest równoważny z aluminiowym adiuwantem; może znacząco zwiększyć ekspresję przeciwciała specyficznego dla OVA typu IgG2a i IgGl. Pokazuje, że polisacharydy z cistanche wzmacniają jednocześnie odpowiedź immunologiczną Th1 i Th2 i nie ma znaczącej różnicy między WCDPS i CCDPS. Wyniki typowania przeciwciał IgG2a wykazały, że grupa koimmunizacji WCDPS i CCDPS oraz OVA może znacząco wzmocnić ekspresję IgG2a w porównaniu z grupą adiuwantów aluminiowych, adiuwant aluminiowy słabiej promuje ekspresję limfocytów T, co dowodzi, że stosuje się WCDPS i CCDPS jako adiuwanty Zdolność do promowania odporności komórkowej jest znacznie wyższa niż w przypadku adiuwantów glinowych.

Wyniki wykrywania proliferacji limfocytów metodą MTT wykazały, że komórki śledziony myszy w każdej grupie były stymulowane przez OVA. Wskaźnik stymulacji (SI) proliferacji limfocytów w WCDPS i CCDPS w połączeniu z OVA był znacząco wyższy niż w grupie immunizacji samym OVA. OVA- Wskaźnik stymulacji w grupie z osadzarką WCDPS 50 Ah i OVA-CCDPS 50 był znacząco wyższy niż w grupie z aluminiowym adiuwantem; wskazuje, że WCDPS i CCDPS w połączeniu z grupą OVA może znacząco zwiększyć proliferację limfocytów specyficznych dla OVA w porównaniu z grupą OVA i grupą adiuwanta glinowego.

Istnieją różne podgrupy limfocytów T. CD3 jest cząsteczką powierzchniową wszystkich limfocytów T. Według różnych fenotypów można je podzielić na limfocyty T CD8 plus i limfocyty T CD4. Cząsteczki CD4 plus mogą powstawać pod wpływem cząsteczek MHC fl, które po aktywacji są wykorzystywane głównie jako komórki pomocnicze (Th). Cząsteczki CD8 plus muszą powstawać pod działaniem cząsteczek MHC I. Po aktywacji stają się komórkami zabójczymi (TC lub CTL), które odgrywają ważną rolę w odporności na infekcje wirusowe i odporności na nowotwory. 3". Cytometria przepływowa wykrywa ekspresję limfocytów T CD3PD4 plus CD3 plus CD8 plus, wyniki pokazują, że WCDPS i CCDPS mogą znacząco promować proliferację limfocytów T CD4 plus T i CD8 plus w pewnym zakresie dawek i nie ma znaczącego różnica między WCDPS i CCDPS przy tej samej dawce Kombinacja CCDPS i OVA może stymulować ekspresję limfocytów T CD3 plus CD4 plus i CD3 plus CD8 plus T, a oba efekty są równoważne.

Podsumowując, WCDPS i CCDPS są bezpieczne jako adiuwanty. Po immunizacji OVA mogą jednocześnie wzmacniać swoistą odporność humoralną i odporność komórkową. W porównaniu z adiuwantami glinowymi, WCDPS i CCDPS mają lepszy wpływ na wzmocnienie odporności komórkowej i nie ma różnicy w działaniu wzmacniającym dwóch polisacharydów z cistanche. Te wyniki badań dostarczają materiałów referencyjnych dla sztucznie hodowanych polisacharydów cistanche w Xinjiang jako adiuwantów, a także stanowią podstawę materiałową do badań przesiewowych bezpiecznych i skutecznych adiuwantów immunologicznych z pustyni Sinciangcistanche.

Bibliografia

[1] Zhao X, Sun W, Zhang S, et al. Odpowiedź immunologiczna adiuwantów polisacharydów z Atractylodis macrocephalus Koidz u kurcząt zaszczepionych przeciwko chorobie Newcastle (ND) [J]. Carbohydr Polym, 2016, 190-196. DOI: 10.1016/j. trzask węglowodanów. 2016. 01.033.

[2]Li J, Wang X, Wang W i in. Ekstrakt wodny ferulanów opłucnowych poprawia dojrzewanie i funkcję komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego myszy poprzez szlak sygnałowy TLR4 [J]. Szczepionka, 2015, 33(16): 1923-1933. DOI: 10.1016/j. szczepionka.2015.02. 063.

[3]Zhao H, Luo Y, Lu C, et al. Odpowiedź immunologiczna błony śluzowej jelit może wywołać aktywność immunomodulacyjną polisacharydu Ganodermy u myszy [J]. Planta Med, 2010, 76(3): 223-227. DOI: 10.1055/S-0029-1186055.