Potencjał przeciwutleniający i przeciwstarzeniowy preparatu peptydowego (Gal2-Pep) skoniugowanego z kwasem galusowym

Skóra jest bardzo narażona na przedwczesne starzeniez powodu stresu zewnętrznego, dlatego w tym badaniu preparat peptydowy (galloil)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) zsyntetyzowano przez połączenie peptydu TPPTTP i galusukwas (GA). Wszystkie peptydy zsyntetyzowano na żywicy chlorku 2-chlorotritylu, stosując peptyd w fazie stałejsyntezy (SPPS) i analizowane na jonizacji przez elektrorozpylanie (ESI)/kwadrupol-czas-of-fflight (Q-TOF) system tandemowej spektroskopii mas (MS). Na początek Gal2–Pep nie wykazał toksyczności poniżej stężenia 100mM ze wskaźnikiem przeżycia komórek wynoszącym 88 procent dla keratynocytów ifibroblasty. TheReaktywne formy tlenu(ROS) działalność wymiatania Gal2–Pep był bardziej stabilny w porównaniu z samą GA; i po czterech tygodniach w pokojutemperatura, jegoDziałanie oczyszczające ROSutrzymał się powyżej 50 proc. Ponadto preparat peptydowy,Gal2–Pep wykazywał również działanie hamujące elastazę w CCD{0}}SkFibroblastówkomórki. Na podstawie wyników RT-qPCR wykazano w tym badaniu, że Gal2–Pep zwiększył ekspresję PGC-1a Dozapobiegaćstres oksydacyjnyi potwierdził jego potencjał jakośrodek przeciwstarzeniowyprzezzwiększenie ekspresjikolagen typu Ii przezzmniejszanie ekspresji metaloproteinazy macierzy -1 (MMP1). TheWyniki otrzymane wzmacniają sugestię, że preparat peptydowy zsyntetyzowany w tym badaniu może być stosowany jakonaturalny przeciwutleniaczIśrodek przeciwstarzeniowydo zastosowań kosmetycznych.

Kliknij tutaj, aby uzyskać więcej informacji o produktach przeciwstarzeniowych Cistanche

1. Wstęp

Starzenie się skórywystępuje w wyniku stopniowego zmniejszania się i ewentualnego zatrzymania podziału komórkowego keratynocytów i brwybuchy w skórze. Zmarszczki na skórze rozwijają się wraz ze spadkiem liczby komórek, a wynikająca z tego denaturacja macierzy pozakomórkowej prowadzi do wysuszenia i utraty elastycznościtkliwość w skórze.1 Uszkodzenie wewnątrzkomórkowego mitochondrialnego DNAwystępuje również zmniejszenie tempa syntezy białekpodczas procesu starzenia się skóry.2 Starzenie się skóry ma dwie główne ścieżkisposoby, wewnętrzne i zewnętrzne, z ekspozycją na promieniowanie ultrafioletowe (UV).

głównym kierowcąstarzenie zewnętrzne. Światło UV reaguje z głównymi składnikami skóry, w tym lipidy, białka i kwasy nukleinowe, do produkcji reaktywnych form tlenu (ROS), które prowadzą do komórekśmierć.3–5 Nadmierne poziomy ROS również prowadzą do rozszczepiania inieprawidłowe wiązanie łańcuchów kolagenu lub elastyny ​​i sprzyjają ekspresji metaloproteinaz macierzy (MMP), takich jak MMP{0}}, które rozkładają kolagen, prowadząc do powstawania zmarszczek iprzyspieszające starzenie się skóry.6,7 Dlatego terapia antyoksydacyjna do usunięciaROS i aktywacja potencjału mitochondrialnego ma zalety ochrony skóry przed starzeniem.

Oprócz ROS, elastaza odgrywa znaczącą rolę w utracieelastyczność skóry, która rozkłada elastynę, ważne białkomacierz pozakomórkowa.8 Elastyna, ze względu na znaczny sprężysty odrzutwłaściwości, zapewniają skórze elastyczność, podczas gdy elastaza takzdolność do rozszczepiania elastyny ​​i innych białek.8 Dlatego hamujenzymu elastazy może być kluczową strategią wiotczenia skóry zapobieganie utracie elastyczności skóry.

W tym badaniu zaprojektowaliśmy nowy materiał, który łączy w sobiekoaktywator gamma receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów1-alfa (PGC-1a)-pochodzący peptyd TPPTTP i kwas galusowy (GA)do stosowania w kosmetykach przeciwstarzeniowych. GA to fitochemikalia występujące w różnych owocach i warzywach, w tym w winogronach, pomidorach i zielonej herbacie, o których wiadomo, że mają wysokie właściwości przeciwutleniające i przeciwbakteryjne eFfect.9 Chociaż GA jest stosowany w przemyśle kosmetycznym i spożywczym ze względu na te korzystne eFfects, jego formuła wydaje się być niestabilna.10 W ten sposób opracowaliśmy (galloil)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) w celu zwiększenia stabilności GA poprzez związanie go z PGC-1a-pochodny peptyd TTPTTP.

W tym badaniu zsyntetyzowaliśmy (galloil)2–KTPPTTP (Gal2– Pep) preparat peptydowy w koniugacji z kwasem galusowym i potwierdzonojego potencjał jako środka przeciwutleniającego i przeciwstarzeniowego.

2. Materiały i metody

2.1. Materiały

Zmodyfikowany przez DulbeccoPożywka Eagle'a (DMEM), penicylina/streptomycyna, płodowa surowica bydlęca (FBS), fosforan buFfumęczonysolankę (PBS) i trypsynę zakupiono od Gibco (Carls

zły, CA). Hydroksybenzotriazol (HOBt), diizopropylokarbodiimid (DIC), 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en (DBU),N, N-diizopropyloetyloamina (DIEA), kwas galusowy iN-sukcynylo-tri-alanylo-pnitroanilid otrzymano z Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).L-Forma aminokwasów (Fmoc-Lys (Boc)–OH, Fmoc-Thr (tBu)–Och, i Fmoc-Pro–OH) zakupiono od Bead-Tech (Seul,Korea).

2.2. Synteza peptydów i peptydów sprzężonych z kwasem galusowym

Wszystkie peptydy zsyntetyzowano na żywicy chlorku 2- chlorku tritylu (200mskala molowa, wartość podstawienia¼ 1,46 mmola g 1) za pomocą HOBt–Synteza peptydów w fazie stałej za pośrednictwem DIC (SPPS).

Syntezę peptydów metodą SPPS przeprowadzono z niewielkimi modamikationy odnoszące się do wcześniejszych badań.11–13 2-żywicę z chlorku chlorotritylu (CTC) spęczniono w dichloro

metan (DCM, 8 ml) przez 30 min. Żywicę przemytodimetyloformamid (DMF). Wszystkie reakcje przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Pochodne aminokwasów zabezpieczone Fmoc (2 równoważniki(Równ.), dlaFipierwszy przyłączony aminokwas lub 5 równ. dla pozostałych aminokwasów) sprzęgano z DIEA (5 równ. dla przyłączonego aminokwasu) lub HOBt/DIC (6 równ./5 równ.) w DMF astopahmprzeprowadzenie odbezpieczenia Fmoc przy użyciu 2 procent (obj./obj.) DBU w DMF (2 razy, co 2 minuty, 8 ml). I wszystkie etapy przemyto 5 razy DMF. Końcowy kwas galusowy sprzęgano z peptydami przyłączonymi do lizyny.Po sprzęganiu kwasu galusowego żywica byłaafiltrowane, myte,i wysuszono pod wysoką próżnią. Roztwór rozszczepiający (TFA:woda dejonizowana [DI]: TIS¼ 95 : 2,5 : 2,5, v/v/v procent) traktowano przez 2 godzinyw celu uzyskania surowych peptydów. Surowe peptydy wytrącono i przemyto trzykrotnie zimnym eterem dietylowym.

Analityczna wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconą fazą(RP-HPLC) przeprowadzono na Waters 2695 SeparationsModuł z kolumną Capcell Pak C18 (4,6 mm 250 mm, 5mm, Shiseido). Faza ruchoma składała się z 0,05% TFA w H2O (faza ruchoma A) i 0,05% TFA w acetonitrylu (faza ruchoma B).

Elucję uzyskano stosując liniowy gradient dla ruchu ruchomegofaza B od 5 procent do 65 procent w ciągu 30 minut w temperaturze aszybkość przepływu 1,0 ml min 1. Piki peptydów wykrywano przy długości fali 230 nm. Półpreparatywna RP-HPLC została przeprowadzona w systemie Waters HPLC (Pump 600E, Detector UV -484) z Gemini RP-C18kolumna (21,2 mm 250 mm, 5mm, Fenomen). Faza ruchoma składała się z 0,05% TFA w H2O (faza ruchoma A)i 0,05 procent TFA w acetonitrylu (faza ruchoma B). Elucję uzyskano stosując liniowy gradient dla fazy ruchomej B7 procent do 22 procent w ciągu 15 minut przy alszybkość przepływu 10 ml min 1. Thepiki peptydowe wykrywano spektrofotometrycznie przy długości fali 230 nm.

Zsyntetyzowane peptydy rozpuszczono w 5% kwasie mrówkowym w wodzie i analizowano metodą jonizacji przez elektrorozpylanie (ESI)/kwadrupol-czas-ltandemowa spektroskopia masowa (Q-TOF).(MS) (TripleTOF6600, ABSciex, Foster City, CA). Próbki wstrzykiwano do wyposażonego w system Q-TOFźródło nano-sprayu w templstawka 1mmin 1. jon ESIparametry źródła były następujące: napięcie rozpylania jonów 1,5 kV, gaz osłonowy przy 10 psi i gaz osłonowy przy 5 psi. Widma wtryb pełnego skanowania i MS/MS zebrano w zakresiem/z

100–1200 Da przy czasie akumulacji 25 ms na widmo.Energię zderzenia zwiększono z 10 do 80. Wynikowadane pozyskano za pomocą Analyst TF tzwware i automatycznieprzypisany przez środek ciężkości 80 procent z minimalnym pikiem, redukcją szumów o 10 procent, średnią deizotopią z progiem 3 procent, bez redukcji szumów i bez wygładzania. Zsyntetyzowane peptydy zostały zidentyfikowanez masową tolerancją 0.05 Da i ręcznie zsekwencjonowano przy użyciu tolerancji MS/MS 0.01 Da.

2.3. Hodowle komórkowe i testy żywotności

Ludzkie, dorosłe komórki o niskiej zawartości wapnia i wysokiej temperaturze (HaCaT).i CCD{0}}Sk (normalna ludzka skórafibroblasty) były komórkihodowane w DMEM z 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyna. Komórki inkubowano w 37°C C w komorze z nawilżonym powietrzem z 5% CO2.Do testów żywotności zastosowano zestaw do liczenia komórek-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Pekin, Chiny). Komórki HaCaT i CCD{2}}Skwysiano w 96-dołkowych mikropłytkach (5 103 komórek na studzienkę) i inkubowano w 37°C C w 5% CO2 przez 24 godz. Hodowle były następnie eksponowane na różne stężenia zsyntetyzowanych peptydów lub GA i inkubowane w 37°C. C w 5% CO2 przez 24 godz. Żywotność komórekzostała następnie zmierzona za pomocą CCK-8 zgodnie z wytycznymi producenta.

2.4. Oznaczanie aktywności przeciwutleniającej

2.4.1. test DPPH.Aktywność przeciwutleniająca syntetyzowanychpeptydy i GA oceniano indywidualnie przy użyciu testu DPPH. Testy DPPH przeprowadzono zgodnie z wcześniej zgłoszonym

metodologia z niewielkimi modyfikacjamikation.12,14–16 Najpierw 0,12 mg ml 1 Roztwór DPPH przygotowano w metanolu, następnie 100mL roztworu DPPH i 100mL zsyntetyzowanych peptydów lub GA zmieszano w różnych stężeniach ({{0}},1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM i 1mM) w 96-dołkowych mikropłytkach. W orbitalnym inkubatorze z wytrząsaniem,mieszaniny poddawano reakcji przez 30 minut w temperaturze 37°C C i 100 obr./min bezświatło. Następnie zmierzono absorbancję przy 517 nm i obliczono pojemność przeciwutleniającą.

2.4.2. Działanie oczyszczające ROS.

Aktywność usuwania wewnątrzkomórkowych ROS oceniano przy użyciu zestawu 20,70-dioctanu dichlorofluoresceiny(DCF-DA, Abcam, USA). Komórki HaCaT wysiano w 96-dołkowych mikropłytkach (5 103 komórek na studzienkę) i inkubowano w 37°C C przez 24 godz.AstopaPo inkubacji hodowle eksponowano na zsyntetyzowane peptydy lub GA (100mM) i inkubowano w 37°C C przez 24 godz. Następnie komórki eksponowano na 10mM roztwór DCF-DA i inkubowano przez 30 min. AstopaPo inkubacji roztwór przemyto PBS. Thekomórki analizowano przy użyciu czytnika mikropłytek przy wzbudzeniu i

długości fal emisji odpowiednio 485 nm i 530 nm.

Ryc. 1Syntetyczne potwierdzenie kroku i sekwencji peptydów przy użyciu czasu kwadrupolowegolot(Q-TOF) spektrometria mas: (a) szczegółowa procedura syntezy (b) TPPTTP, (c) galoil–TPPTTP i d) (galoil)2–KTPPTTP.

2.5. Test potencjału błony mitochondrialnej

Barwnik JC -1 (Thermo Fisher, USA) zastosowano do mitochondriówtest potencjału błonowego (MmP). Komórki CCD{0}}Sk i HaCaT wysiano w 96-dołkowych mikropłytkach (5 10 3komórek na studzienkę)

i inkubowano w 37°C C i 5% CO2 przez 24 godz. Na rufieeee inkubacja,hodowle eksponowano na różne stężenia zsyntetyzowanych peptydów i inkubowano w 37°C C w 5% CO2 przez 24 godz.Barwnik JC-1 dodano do komórek CCD-1064Sk i HaCaT w celuprodukować koncentracja 10mM. AstopaPo 10 minutach inkubacji komórki przemyto dwukrotnie 37 C PBS. Zielony i czerwonyfluorescencjamierzono za pomocą Varioskan LUXWielomodowy czytnik mikropłytek (ThermoFisher, USA) w firmie excistacja (lByły)/emisja (lEm) 475/530 nm i alByły/lEmz 475/odpowiednio 590 nm.

2.6. Test aktywności hamującej elastazę

Komórki CCD{0}}Sk wysiano w 6-płytkach ze studzienkami i inkubowano w temperaturze 37 C w 5% CO2 przez 24 godz. Hodowle następnie eksponowano na stężenie 100mM zsyntetyzowanych peptydów lub GA i inkubowano w 37°C C w 5% CO2 przez 24 godz. Komórki przemyto dwukrotnie dPBS i zebraliśmy każdą komórkę za pomocą skrobaczki do komórek. Aer dodawanie 0,2 M Tris–HCl (pH 8,0) z 0,1 procent Triton-X do zebranegokomórki, komórki homogenizowano za pomocą ultradźwięków. Zhomogenizowany roztwór wirowano przez 20 minut przy 3000 obr./mini 4 C. Następniestopaer biorąc supernatant, ilościowe białka-kation przeprowadzono przy użyciu testu białka BCA. Białko dla każdegopróbka została wydana wFistężenie końcowe 100mgml 1, IN-sukcynylo-tri-alanylo-p-nitroanilid dodano wkońcowe stężenie 1,6 mM i reagowało w 36°C C przez 1 godz.Następnie zmierzono absorbancję przy 405 nm za pomocą czytnika mikropłytek.

2.7. RT-qPCR

Poziomy mRNA markerów przeciwstarzeniowych w komórkach CCK{1}}Skoceniano za pomocą RT-qPCR. Całkowity RNA zebrano przy użyciu odczynnika TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA) i odwrotnie

transkrybowane przy użyciu zestawu odczynników PrimeScript RT (Takara BioInc., Kusatsu, Japonia). System CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) i iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora

tories) użyto do RT-qPCR.b-Aktyny użyto do normalizacji poziomów mRNA kolagenu typu I, MMP{1}} i PGC-1a. 

2.8. Analiza statystyczna

 Dane przedstawiono jako średnią odchylenie standardowe odtrzy niezależne pomiary i analizowane metodą Studentat-testy, zp < 0.05 considered to be a signinie mogę się różnić.

Zapytaj o więcej:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950