Charakterystyka kliniczna, diagnoza, wyniki i analiza mikrobiomu płuc inwazyjnej aspergilozy płucnej u pacjentów z pozaszpitalnym zapaleniem płuc

ABSTRAKCYJNY

Tło

Inwazyjna aspergiloza płucna (IPA) pozostaje niedoceniana u pacjentów z pozaszpitalnym zapaleniem płuc (CAP). To badanie ma na celu opisanie cech klinicznych i wyników IPA u pacjentów z PZP, ocenę wydajności diagnostycznej sekwencjonowania metagenomicznego nowej generacji (mNGS) dla IPA oraz analizę mikrobiomu płuc za pomocą danych mNGS.

Ostatnio epidemia nowego koronawirusa wywołanego zapaleniem płuc przyciągnęła powszechną uwagę na całym świecie. Wiele osób zaczęło zwracać uwagę na to, czy ich odporność jest wystarczająco silna, ponieważ odporność jest pierwszą linią obrony organizmu przed chorobami. W tym artykule badamy związek między zapaleniem płuc a odpornością.

Zapalenie płuc jest poważną infekcją dróg oddechowych i chorobą zapalną spowodowaną wieloma przyczynami. Wirusy, takie jak przeziębienie, grypa i nowy koronawirus, mogą powodować zapalenie płuc. Głównym celem tej choroby jest to, że powoduje nieodwracalne uszkodzenie układu oddechowego i może prowadzić do niewydolności oddechowej.

Jeśli jednak twoja odporność jest odpowiednia, twoje ciało jest lepiej przygotowane do walki z wirusami i bakteriami. Dzieje się tak głównie za sprawą białych krwinek – jednej z najważniejszych komórek odpornościowych organizmu. Białe krwinki mogą rozpoznawać atakujące patogeny i atakować je bezpośrednio, a także mogą wydzielać przeciwciała w celu obrony przed inwazją patogenów.

Oprócz białych krwinek, niektóre inne ważne elementy układu odpornościowego obejmują limfocyty i fagocytozę. Limfocyty aktywują układ odpornościowy, rozpoznając obce patogeny, podczas gdy fagocytoza ma miejsce, gdy pewne typy białych krwinek pochłaniają i rozkładają patogeny, takie jak inwazyjne bakterie.

Tak więc utrzymanie zdrowego układu odpornościowego jest skutecznym sposobem zapobiegania infekcjom dróg oddechowych, takim jak zapalenie płuc. Możesz poprawić swoją odporność, jedząc pokarmy bogate w witaminy, białka i przeciwutleniacze, takie jak ryby głębinowe, orzechy, fasola, truskawki, jagody i inne. Ponadto bardzo ważne jest utrzymanie dobrego stanu zdrowia, w tym niepalenie, więcej ćwiczeń fizycznych, utrzymanie dobrego snu i zmniejszenie stresu.

Krótko mówiąc, aby uniknąć infekcji dróg oddechowych, takich jak zapalenie płuc, konieczne jest utrzymanie dobrej odporności. Musimy poprawić odporność organizmu poprzez zdrową dietę, odpowiednią aktywność fizyczną i nawyki związane ze snem. Rozsądnie zaplanuj swój styl życia, aby Twój organizm miał lepszy mechanizm obronny i trzymał się z dala od chorób, takich jak zapalenie płuc. Z tego punktu widzenia musimy poprawić naszą odporność. Cistanche może znacznie poprawić odporność, ponieważ popiół mięsny zawiera różnorodne biologicznie aktywne składniki, takie jak polisacharydy, dwa grzyby, Huang Li itp. Składniki te mogą stymulować układ odpornościowy Różne typy komórek w systemie, zwiększają ich aktywność immunologiczną.

Kliknij korzyści zdrowotne cistanche

Metody

To retrospektywne badanie kohortowe obejmowało pacjentów z PZP w okresie od 22 kwietnia 2019 r. do 30 września 2021 r. Przeanalizowano dane kliniczne i mikrobiologiczne. Skuteczność diagnostyczną mNGS porównano z tradycyjnymi metodami wykrywania. Scharakteryzowano mikrobiom płuc wykryty przez mNGS i oceniono jego związek z cechami klinicznymi.

Wyniki główne

IPA rozpoznano u 26 (23,4 procent) ze 111 pacjentów z PZP. Pacjenci z IPA wykazywali obniżoną odporność, wyższą śmiertelność w szpitalu (30,8 procent vs 11,8 procent) i śmiertelność na oddziałach intensywnej terapii (42,1 procent vs 17,5 procent) w porównaniu z pacjentami bez IPA. Test antygenu galaktomannanu (GM) miał najwyższą czułość (57,7 procent) w wykrywaniu Aspergillus spp, następnie mNGS (42,3 procent), hodowlę (30,8 procent) i rozmaz (7,7 procent). Kubki, kultura i rozmaz miały 100-procentową specyficzność, podczas gdy test GM miał 92,9-procentową specyficzność. Struktura mikrobiologiczna IPA znacznie różniła się od pacjentów bez IPA (p<0.001; Wilcoxon test). Nineteen different species were significantly correlated with clinical outcomes and laboratory biomarkers, particularly for Streptococcus salivarius, Prevotella timonensis, and Human betaherpesvirus 5.

Wnioski

Nasze wyniki pokazują, że pacjenci z zakażeniem Aspergillus mają zwykle wyższy wskaźnik wczesnej śmiertelności. NGS można zaproponować jako uzupełnienie rutynowych badań mikrobiologicznych w diagnostyce pacjentów zagrożonych zakażeniem Aspergillus. Mikroflora płuc jest związana ze stanami zapalnymi, immunologicznymi i metabolicznymi IPA, a tym samym wpływa na wyniki kliniczne.

WSTĘP

Inwazyjna aspergiloza płuc (IPA) jest ważną przyczyną zachorowalności i śmiertelności, zazwyczaj dotykając gospodarzy z obniżoną odpornością, takich jak pacjenci zakażeni wirusem HIV, jak również pacjenci otrzymujący leczenie kortykosteroidami, biorcy przeszczepów lub nowotwory hematologiczne.1 Liczne przypadki błędnej diagnozy lub pominięcia diagnozy i z powodu braku środków medycznych i nowych czynników ryzyka są niedoszacowane.2 Rozpoznanie kliniczne IPA obejmuje czynniki gospodarza, cechy kliniczne i dowody mikologiczne.3 Problemy wynikające z niedostępności próbek tkanek, niskiej czułości hodowli, małej przydatności tradycyjne czynniki żywiciela i brak typowych objawów klinicznych i radiologicznych prowadzą do opóźnionego lub pominiętego rozpoznania u pacjentów z IPA.4 Niedawno opublikowane wytyczne praktyki klinicznej American Thoracic Society dotyczące diagnozowania infekcji grzybiczych podkreślają niezależne od posiewu testy diagnostyczne, z mocnymi zaleceniami dotyczącymi wykrycie DNA Aspergillus w płynie z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych (BALF) metodą PCR.5.

W ostatniej dekadzie rozwój molekularnych metod oznaczania ilościowego i sekwencjonowania patogennego DNA znacznie ułatwił wykrywanie różnych mikroorganizmów. Metagenomiczne sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) jest obecnie szeroko stosowane w diagnostyce chorób zakaźnych w warunkach klinicznych, zwłaszcza w przypadku specyficznych lub niezidentyfikowanych lub mieszanych patogenów w podejściu nieukierunkowanym.6 Na przykład połączenie mNGS z konwencjonalnymi metodami wykrywania może zwiększyć wykrywalności kompleksu Mycobacterium tuberculosis7 i ułatwiają wykrywanie mieszanych patogenów u pacjentów z ciężkim pozaszpitalnym zapaleniem płuc (PZP) z obniżoną odpornością.8 Do tej pory skuteczność diagnostyczna NGS w wykrywaniu zakażenia aspergilozą płuc nie była jasna.

Ostatnio opisano różnice w składzie i różnorodności mikrobiomów płuc w przypadku wielu chorób układu oddechowego, dostarczając nowych widoków dla precyzyjnej diagnozy. Pacjenci z bakteriologicznie potwierdzoną gruźlicą wykazywali znaczny wzrost liczby gatunków bakterii w porównaniu z pacjentami z ujemnym wynikiem testu na gruźlicę.9 Brak równowagi społeczności płucnej spowodowany wzbogaceniem w potencjalny patogen jest skorelowany z wynikami u pacjentów zaintubowanych/wentylowanych mechanicznie.10 Hérivaux i wsp. odkryli pacjentów z IPA wykazywały zróżnicowaną obfitość określonych taksonów bakteryjnych.11

Dzięki dostępnym nowszym technikom diagnostycznym możliwa jest ocena charakterystyki klinicznej i mikrobiomu płucnego IPA z nowej perspektywy w celu kompleksowego zrozumienia choroby. To badanie zostało zaprojektowane w celu opisania cech klinicznych i wyników IPA u pacjentów z CAP, oceny skuteczności diagnostycznej mNGS dla IPA i ujawnienia związku między cechami klinicznymi a mikrobiomem płuc w IPA.

METODY

Projekt badania i uczestnicy

Było to retrospektywne badanie kohortowe, które obejmowało hospitalizowanych pacjentów (w wieku co najmniej 18 lat) ze zdiagnozowanym PZP w Pierwszym Stowarzyszonym Szpitalu Chongqing Medical University w okresie od 22 kwietnia 2019 r. do 30 września 2021 r. Pacjenci włączeni do tego badania powinni spełniać następujące kryteria włączające: (1) rozpoznanie PZP spełniające wytyczne IDSA/ATS z 2007 r.12, (2) wykonanie płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, (3) brak ekspozycji na antybiotyki w ciągu ostatnich 2 tygodni przed pobraniem próbki oraz (4) wykonanie testu na galaktomannan (GM), wyniki rozmazu, hodowli i BALF mNGS BALF. Przypadki prawdopodobnego IPA wymagają obecności co najmniej jednego czynnika żywiciela, manifestacji klinicznej i dowodów mikologicznych w BALF, zgodnie z kryteriami Europejskiej Organizacji Badań i Leczenia Raka/Mycoses Study Group z 2019 r. (EORTIC/MSG).3 W tym badaniu modyfikacją kryteriów diagnostycznych było dodanie NGS jako jednej z metod badań mikologicznych, w tym testu GM, rozmazu i hodowli. Przypadki bez prawdopodobnego IPA obejmowały pacjentów bez dowodów klinicznych lub radiologicznych lub obecności Aspergillus spp w BALF. Wszyscy zarejestrowani pacjenci byli obserwowani przez telefon w celu uzyskania informacji o przeżyciu lub dacie śmierci.

Zbieranie danych i badania mikrobiologiczne

Informacje kliniczne zostały wyodrębnione z elektronicznej dokumentacji medycznej przy użyciu standardowego formularza gromadzenia danych, który obejmował dane demograficzne, dane kliniczne, wyniki badań laboratoryjnych, tomografię komputerową klatki piersiowej, leczenie przeciwgrzybicze i wyniki. Wszystkie dane zostały przejrzane przez dwóch niezależnych badaczy w celu zweryfikowania dokładności danych. Skala porządkowa 7-kategorii13 została zmodyfikowana w oparciu o projekt badania, który składał się z następujących wzajemnie wykluczających się kategorii: kategoria 7, śmierć; kategoria 6, wymagająca wentylacji inwazyjnej i dodatkowego wsparcia narządów (np. ciągłej terapii nerkozastępczej lub pozaustrojowej oksygenacji membranowej); kategoria 5, wymagająca inwazyjnej wentylacji mechanicznej; kategoria 4, wymagająca nieinwazyjnej wentylacji lub wysokiego przepływu tlenu; kategoria 3, wymagająca dodatkowego tlenu przez maskę lub końcówki nosowe; kategoria 2, hospitalizowany, bez tlenu; kategoria 1, zwolniony. Poprawę stanu klinicznego zdefiniowano jako spadek o 2 kategorie oceniany na 7-poziomowej skali porządkowej w ustalonych punktach czasowych (dni 1, 7, 14, 21 i 28).
Badanie na obecność antygenu GM w surowicy i GM w BALF jest generalnie wykonywane u wszystkich włączonych pacjentów. Wynik uznano za pozytywny, gdy wartości indeksu optycznego były większe lub równe 1.0 w surowicy lub większe lub równe 1.0 w BALF lub większe lub równe 0 0,7 w surowicy i większe lub równe 0,8 w BALF. Próbki BALF poddano mNGS, rozmazowi pod mikroskopem i zwykłej hodowli grzybów.

Sekwencjonowanie nowej generacji w metagenomice

Od każdego pacjenta pobrano 1,5–3 ml BALF zgodnie ze standardowymi procedurami.14 Probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającą 0,6 ml próbki BALF, enzym i 1 g szklanych kulek 0,5 mm mieszano przez w mieszalniku wibracyjnym i 0},3 ml próbki rozdzielono do 1,5 ml probówki do mikrowirówki i DNA wyekstrahowano przy użyciu zestawu TIANamp Micro DNA Kit (DP316, Tiangen Biotech) zgodnie z instrukcją producenta. 15 bibliotek DNA skonstruowano za pomocą DNA fragmentacja, naprawa końców, ligacja adaptera i amplifikacja PCR. Następnie biblioteki o potwierdzonej jakości zostały zsekwencjonowane przez platformę Illumina NextSeq 550 z pojedynczymi odczytami 75 bp (Illumina, San Diego, Kalifornia, USA).16

Kontrola wewnętrzna, nazwana unikalnym dodatkiem molekularnym (UMSI), została dodana do próbki przed ekstrakcją DNA. Sekwencja UMSI różniła się w różnych próbkach. Każda seria testów NGS obejmowała zewnętrzną kontrolę negatywną, która była wykonywana równolegle z próbkami klinicznymi. Podczas analizy można było stwierdzić zanieczyszczenie między próbkami, jeśli sekwencja UMSI była taka sama lub odczyty niektórych patogenów w kontroli zewnętrznej były bardzo wysokie.

Dane sekwencjonowania wysokiej jakości wygenerowano przez usunięcie odczytów niskiej jakości, a następnie odjęcie obliczeniowe sekwencji ludzkiego gospodarza zmapowanych do ludzkiego genomu odniesienia (hg19) przy użyciu dopasowania Burrowsa-Wheelera.17 Pozostałe dane przez usunięcie odczytów o niskiej złożoności zostały sklasyfikowane poprzez jednoczesne dopasowanie do czterech baz danych genomu drobnoustrojów (bakterie, grzyby, wirusy i pasożyty), które pobrano z National Center for Biotechnology Information (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/). Interpretację moich wyników można zobaczyć w metodach uzupełniających online.

Zaangażowanie pacjentów i społeczeństwa

Pacjenci i opinia publiczna nie byli zaangażowani w projektowanie i prowadzenie tego badania, wybór miar wyników ani rekrutację. Wyniki tego badania nie będą rozpowszechniane wśród uczestników i powiązanych społeczności.

Analizy statystyczne

Zmienne ciągłe wyrażono jako medianę (IQR) i porównano z testem U Manna-Whitneya. Zmienne kategoryczne wyrażono w postaci liczb (procent) i porównano testem χ2 lub dokładnym testem Fishera. Tabele kontyngencji 2 × 2 zostały utworzone w celu określenia czułości, swoistości, dodatniej wartości predykcyjnej (PPV) i ujemnej wartości predykcyjnej (NPV). Wynik dwustronny mniejszy niż 0.05 uznano za istotny statystycznie. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu IBM SPSS Statistics, V.23.0, o ile nie wskazano inaczej.

Odczyty wysokiej jakości zostały najpierw zmapowane do ludzkiego genomu referencyjnego (hg19), a następnie odczyty inne niż ludzkie zostały dopasowane do czterech baz danych genomu drobnoustrojów (bakterie, grzyby, wirusy i pasożyty). Po usunięciu drobnoustrojów tła, które pojawiły się w kontrolach negatywnych (tabela uzupełniająca online 1), do oszacowania względnej obfitości gatunków zastosowano ponowne oszacowanie liczebności Bayesa (tabela uzupełniająca online 2). Wskaźnik różnorodności alfa dla każdej próbki obliczono na podstawie wskaźników Shannona i Simpsona, a różnorodność beta obliczono na podstawie ważonej odległości UniFrac i odległości Braya-Curtisa. Wartości P dla analizy alfa i beta obliczono stosując test sumy rang Wilcoxona. Zastosowano wielkość efektu liniowej analizy dyskryminacyjnej (LDA), aby znaleźć znacząco różne gatunki między grupami, z progami log10 Wynik LDA większy lub równy 2 i wartość p mniejsza lub równa 0,05. Korelacja między reprezentatywną mikroflorą a danymi klinicznymi została oceniona przez Spearmana.

WYNIKI

Rekrutacja pacjentów i charakterystyka kliniczna

Ogółem przeanalizowano 123 pacjentów z 128 próbkami BALF i 111 pacjentów włączono do tego badania.

U dwudziestu sześciu pacjentów zdiagnozowano prawdopodobną IPA (nazwaną IPA) i 85 kontroli bez IPA (nazwa kontroli) (ryc. 1). Porównania cech demograficznych i klinicznych między grupą IPA a grupą kontrolną podsumowano w tabeli 1. Mediana wieku badanej populacji wynosiła 60 (IQR, 53–73) lat, a 66,7 procent stanowili mężczyźni. Ogółem 33 pacjentów (29,7 procent) miało w przeszłości palenie. Dwudziestu dwóch pacjentów (19,8 procent) miało przewlekłą obturacyjną chorobę płuc. Piętnastu pacjentów (13,5 procent) otrzymywało kortykosteroidy, a 36 pacjentów (32,4 procent) uznano za osoby z obniżoną odpornością (tabela uzupełniająca online 3). Pacjenci z prawdopodobnym IPA mieli znacznie wyższy odsetek znanych czynników ryzyka aspergilozy niż pacjenci bez IPA, w tym leczenie kortykosteroidami przez ponad 28 dni (38,5 procent w porównaniu z 5,9 procent, p=0.{27}}) oraz obniżoną odporność status (53,8 procent vs 25,9 procent, p=0,008). Nie stwierdzono istotnych różnic w punktacji oceny niewydolności narządowej i dezorientacji, moczniku, częstości oddechów, ciśnieniu krwi i wieku 65 pacjentów między dwiema grupami przy przyjęciu.

Obrazy mikrobiologiczne, tomografia komputerowa i wyniki badań laboratoryjnych

Izolaty Aspergillus fumigatus otrzymano dla 6 z 26 (23,1 procent) prawdopodobnych przypadków IPA, następnie Aspergillus flavus dla 3 z 26 (11,5 procent) i Aspergillus ustus dla 1 z 26 (3,8 procent) (tabela 2). Pogrubienie ściany oskrzeli było częściej widoczne w TK klatki piersiowej w IPA (44,0 procent vs 12,8 procent, p=0,{18}}) (tabela 2). Pacjenci z IPA mają znacznie niższy poziom całkowitej liczby limfocytów (774,1 vs 1088,9, p=0.009) i subpopulacji limfocytów, w tym CD3 plus liczba limfocytów T (553,0 vs 782,6, p=0,016), liczba limfocytów T CD4 plus (287,9 vs 409,5, p=0,031) i liczba limfocytów T CD4- CD8- (25,9 vs 45,0, p=0,007 ) niż pacjenci z grupy kontrolnej (tabela uzupełniająca online 4), co wskazuje na upośledzoną funkcję immunologiczną pacjentów z IPA.

Porównanie skuteczności diagnostycznej

Aby porównać skuteczność diagnostyczną BALF mNGS i konwencjonalnych testów do odróżniania przypadków z prawdopodobnym IPA od przypadków bez prawdopodobnego IPA, wyniki przedstawiono na rycinie 2. Test GM (57,7 procent) miał najwyższą czułość w wykrywaniu Aspergillus spp, a następnie mNGS (42,3 proc.), posiew (3{26}}},8 proc.) i rozmaz (7,7 proc.). W porównaniu z rozmazem, mNGS miał znacznie wyższą czułość 42,3% vs 7,7%, p=0.{{30}}1). mNGS, kultura i rozmaz miały swoistość 100%, podczas gdy test GM miał swoistość 92,9%, z istotną różnicą między mNGS (lub kulturą lub rozmazem) a testem GM (p{ {18}}.029). PPV mNGS, hodowli i rozmazu do identyfikacji Aspergillus spp wyniósł 100 procent, podczas gdy test GM wyniósł 71,4 procent. NPV oceniono jako test GM (87,8 procent), mNGS (85,0 procent), hodowlę (82,5 procent) i rozmaz (78,0 procent), bez znaczącej różnicy między tymi metodami. Przeanalizowaliśmy różnice w czułości / specyficzności / PPV / NPV GM w surowicy w porównaniu z BALF, stosując wskaźnik GM płynu BAL większy niż lub równy 1,0 lub wskaźnik GM surowicy większy niż lub równy 1,0 jako pozytywny, zgodnie z 2019 EORTIC /MSG. Czułość była znacząco wyższa, ale niższa pod względem specyficzności GM BALF niż w przypadku surowicy GM (odpowiednio 57,7% vs 26,9%, p=0,048, 92,9% vs 100%, 0,029), co wykazano w tabela uzupełniająca online 5. Nie było różnic w PPV i NPV.

Wyniki kliniczne

Nie było znaczących różnic w śmiertelności 28-dnia, 60-dnia i 90-dnia między dwiema grupami (tabela 3). Śmiertelność szpitalna (30,8% vs 11,8%, p=0,021) i śmiertelność na oddziałach intensywnej terapii (OIOM) (42,1% vs 17,5%, p=0,029) były znacznie wyższe w grupie IPA niż w grupie kontrolnej. Rozkład pacjentów należących do każdej kategorii 7-skali kategorii wykazał statystyczną różnicę między dwiema grupami do dnia 28 (p=0,017); jednak istotność w testach statystycznych nie została osiągnięta w 7-kategorii na skali porządkowej w dniach 1, 7 i 14 (ryc. 3). Wiele leków przeciwgrzybiczych podano 23,1 procentom pacjentów z prawdopodobnym IPA, w porównaniu z 5,9 procentami pacjentów bez prawdopodobnego IPA (p{29}},01). Odsetek pacjentów otrzymujących worykonazol był znacznie wyższy w przypadku prawdopodobnego IPA (53,9 procent vs 8,2 procent, p=0.{36}}). Nie było istotnej różnicy w stosowaniu amfoterycyny B i kaspofunginy między dwiema grupami (tabela 3).

Analiza mikrobiomu płuc

Aby porównać ogólny skład i różnorodność sygnatury mikrobiologicznej płuc u pacjentów z IPA i grupą kontrolną, przeanalizowaliśmy próbki BALF pobrane od 109 pacjentów z CAP, w tym 24 przypadki (brak 2 pacjentów z powodu utraty danych mNGS) z rozpoznaniem prawdopodobnego IPA (o nazwie IPA) i 85 przypadków bez prawdopodobnego IPA (nazwana kontrola). Oceniliśmy różnorodność społeczności płuc za pomocą wskaźnika różnorodności Shannona i Simpsona. Nastąpił spadek różnorodności zarówno we wskaźniku różnorodności Shannona, jak i Simpsona u pacjentów z IPA w porównaniu z pacjentami bez IPA, pomimo istotnych różnic (ryc. 4A, B). Korzystając z ważonej metryki UniFrac i metryki Bray-Curtisa, zaobserwowaliśmy, że różnorodność pacjentów z IPA znacznie różniła się od pacjentów bez IPA (p<0.001; Wilcoxon test), suggesting that lung community structure of patients diagnosed with probable IPA differed substantially from those without probable IPA (figure 4C, D). Based on the average relative abundance, we plotted the top 10 phyla, genera, and species among 2 groups. 

W całej kohorcie Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes i Ascomycota były najliczniejszymi gromadami, podczas gdy Prevotella, Streptococcus, Acinetobacter i Pneumocystis były najczęstszymi rodzajami (ryc. 5A, B). Względna liczebność pierwszej dziesiątki gatunków sklasyfikowanych jako Pneumocystis jirovecii, Acinetobacter baumannii, Lautropia mirabilis, Streptococcus oralis, Corynebacterium striatum, ludzki betaherpeswirus 5, Rothia mucilaginosa, Staphylococcus aureus, Prevotella melanogenic, Nocardia Farcinica, tylko z H. betaherpeswirusem 5 była znacznie różnią się między dwiema grupami (ryc. 5C). Koncentrując się na różnych gatunkach w IPA w porównaniu z ich kontrolami, znaleźliśmy 21 gatunków z wynikiem LDA większym lub równym 2 i p<0.05, which H. betaherpesvirus 5, A. fumigatus, Aspergillus niger, Citrobacter braakii, Bacillus thermoamylovorans, Helcococcus kunzite, Lactobacillus delbrueckii, Burkholderia dolosa, Marinobacter hydrocarbonoclasticus, Riemerella anatipestifer, Corynebacterium halotolerant, and Lactobacillus plantarum were significantly abundant in the cases diagnosed with probable IPA, and Streptococcus salivarius, Citrobacter freundii, Paraburkholderia fungorum, Dolosigranulum program, Prevotella timonensis, Sphingobium yanoikuyae, Serratia marcescens, and Corynebacterium oculi were enriched in cases without probable IPA (figure 5D, online supplemental figure 1).

Aby dokładniej zbadać korelację między danymi klinicznymi a mikroflorą płuc IPA, przeprowadziliśmy test korelacji oparty na rangach Spearmana na 21 istotnie różnych gatunkach z wynikami klinicznymi i wynikami badań laboratoryjnych (ryc. 6A). Zaobserwowaliśmy, że 19 różnych gatunków było istotnie skorelowanych z 7 wynikami klinicznymi i 22 biomarkerami laboratoryjnymi, w szczególności S. salivarius, P. Sinensis i H. betaherpeswirus 5. S. salivarius był głównie dodatnio skorelowany z ośmioma biomarkerami laboratoryjnymi, w tym krwinkami czerwonymi, łącznie limfocyty, limfocyty T, komórki pomocnicze T, cytotoksyczne limfocyty T, limfocyty B, potas w surowicy i albuminy oraz ujemnie względny z aminotransferazą asparaginianową, bilirubiną bezpośrednią i D-dimerami. Podczas gdy S. salivarius był głównie negatywnie powiązany z 11 wynikami klinicznymi, w tym śmiertelnością na OIOM, czasem pobytu na OIOM, śmiertelnością w szpitalu, śmiertelnością w 28. w dniu 28, dni bez respiratora w ciągu 28 dni i czas do poprawy stanu klinicznego. Podobnie jak S. salivarius, P. timonensis był głównie pozytywnie skorelowany z sześcioma biomarkerami laboratoryjnymi, w tym limfocytami całkowitymi, limfocytami T, komórkami pomocniczymi T, limfocytami T CD4- CD8-, limfocytami B i potasem w surowicy, i ujemnie skorelowany z prokalcytoniną.

Podobnie P. timonensis był głównie negatywnie związany z czasem pobytu na OIT i śmiertelnością w szpitalu, ale pozytywnie z dniami bez respiratora w ciągu 28 dni. W przeciwieństwie do S. salivarius i P. Sinensis, H. betaherpeswirus 5 był ujemnie powiązany z sześcioma biomarkerami laboratoryjnymi, w tym limfocytami całkowitymi, limfocytami T, komórkami pomocniczymi T, limfocytami T CD4 plus CD8 plus, limfocytami B i potasem w surowicy, i dodatni z azot mocznikowy we krwi. Tymczasem H. betaherpeswirus 5 był głównie ujemnie skorelowany z czasem pobytu na OIOM i czasem do uzupełnienia niezależności tlenowej w ciągu 28 dni. Obserwacje te sugerują, że dysbioza społeczności drobnoustrojów w płucach jest związana ze stanami patofizjologicznymi pacjenta, a zatem może wpływać na wyniki kliniczne.

Aby dokładniej zbadać wpływ kliniczny 21 znacząco różnych gatunków, przeprowadziliśmy analizę przeżycia, wykreślając krzywą skumulowanego prawdopodobieństwa. Jak pokazano na rycinach 6B i C, wykrycie A. fumigatus i H. betaherpeswirusa 5 istotnie przewidywało gorsze wyniki na OIT (p=0.{5}}45, 0,032) . Podczas gdy na rycinie 6D, E stwierdziliśmy, że wykrycie S. salivarius i P. timonensis było niezwykle istotnie predykcyjne dla lepszych wyników OIOM (p=0,0031, 0,0054). Doszliśmy zatem do wniosku, że w przypadku mikroflory płuc PZP wyniki OIOM można przewidzieć na podstawie składu społeczności, w szczególności A. fumigatus, H. betaherpesvirus 5, S. salivarius i P. Sinensis.

DYSKUSJA

W tym retrospektywnym badaniu kohortowym zbadaliśmy charakterystykę kliniczną IPA. Co ciekawe, zauważyliśmy, że pacjenci sklasyfikowani jako mający prawdopodobne zakażenie Aspergillus mieli znacznie wyższą śmiertelność szpitalną (30,8 procent) i śmiertelność na OIOM-ie (42,1 procent) w porównaniu z grupą kontrolną. Śmiertelność w dniu 28, choć nieistotna statystycznie, była liczbowo wyższa u pacjentów z IPA niż w grupie kontrolnej. Dane te sugerują, że pacjenci z zakażeniem Aspergillus mają zwykle wyższy wskaźnik wczesnej śmiertelności. W poprzednim badaniu oszacowano, że śmiertelność na oddziałach intensywnej terapii wynosiła 45 procent, a śmiertelność w szpitalach 26 procent. 18 Wśród inwazyjnej aspergilozy tchawiczo-oskrzelowej, rzadkiej jednostki chorobowej IPA, śmiertelność 30-dniowa i 90-dniowa wynosiła nawet 90 procent. 19 Loughlin i wsp. stwierdzili, że śmiertelność na OIT u pacjentów z prawdopodobnym zakażeniem Aspergillus nie była istotnie wyższa niż u pacjentów bez zakażenia Aspergillus, 4 co prawdopodobnie wynika z ogólnego stanu krytycznego w kohorcie pacjentów z zapaleniem płuc związanym z respiratorem na oddziałach intensywnej terapii. W tym badaniu ogólny stan włączonych pacjentów z PZP był stosunkowo łagodny, co może być znacznie pogorszone przez zakażenie Aspergillus i potencjalnie zagrażające życiu.

Cornillet i wsp. zasugerowali, że niespecyficzne cechy kliniczne i trudności diagnostyczne pacjentów z IPA, zwłaszcza u pacjentów bez neutropenii, łatwo prowadzą do nieoptymalnego postępowania i opóźnionego rozpoczęcia leczenia, co skutkuje wysoką śmiertelnością i chorobowością. a dokładna diagnoza jest pilnie potrzebna do skutecznego leczenia przeciwgrzybiczego w celu zmniejszenia zachorowalności i śmiertelności. W ostatniej dekadzie wykrywanie GM było szeroko stosowane w diagnostyce IPA.21 Jednak badanie GM w próbkach surowicy ma ograniczoną czułość w diagnozowaniu IPA u gospodarzy bez neutropenii.22 Zamiast tego wykrywanie GM w próbkach płynu BAL pobranych od pacjentów zagrożony IPA ma doskonałą dokładność diagnostyczną23 24, ponieważ GM jest uwalniany wcześniej iw wyższych stężeniach w płynie BAL w porównaniu z surowicą.25 Ostatnio mNGS odgrywa coraz ważniejszą rolę w diagnostyce chorób grzybiczych. Ding i wsp. wykazali, że czułość mNGS była znacznie wyższa niż hodowla w wykrywaniu Candida albicans. 9 W tym badaniu BALF pobrano bezpośrednio z dolnych dróg oddechowych, co pozwoliło uniknąć zanieczyszczenia mikrobiomem jamy ustnej. Aspergillus w BALF wykryto za pomocą mNGS, hodowli, rozmazu i testu GM. Wyniki pokazały, że NGS miał porównywalną specyficzność i PPV do hodowli w wykrywaniu Aspergillus. Chociaż czułość mNGS była niższa niż testu GM, mNGS wykazało większą czułość niż rozmaz i większą swoistość niż testy surowicy i BALF GM. Wyniki te wskazują, że mNGS działa jako użyteczny test nie oparty na hodowli do wykrywania Aspergillus, co sugeruje uzupełnienie rutynowych testów mikrobiologicznych w diagnostyce pacjentów zagrożonych IPA.

Nasze badanie wykazało, że pacjenci z PZP z Aspergillus byli bardziej narażeni na współzakażenie infekcją bakteryjną lub (i) wirusową ze względu na stan obniżonej odporności i leczenie kortykosteroidami. Zgłaszano, że u pacjentów z grypą z obniżoną odpornością częstość występowania IPA wynosiła nawet 32 ​​procent, podczas gdy w grupie przypadków grypy bez obniżonej odporności zapadalność wynosiła 14 procent.18 Wraz z pojawieniem się pandemii COVID{4}} i kortykosteroidów u pacjentów z ciężkim COVID{5}}26, w kilku opisach przypadków opisano aspergilozę płuc (CAPA) związaną z COVID{5}}26.27-29 W metaanalizie częstość występowania i śmiertelność CAPA na OIOM oszacowano odpowiednio na 10,2 proc. i 54,9 proc.30

Ze względu na rozległe odczyty mikrobiologiczne w danych mNGS, które można wykorzystać do analizy sygnatur drobnoustrojów w wielu chorobach, w naszym badaniu podjęto próbę zbadania różnicy w strukturze i składzie mikrobiomu między pacjentami z IPA a pacjentami z CAP bez IPA, analizując dane mNGS. Nasze obecne badanie obejmowało mikroflorę płucną 24 pacjentów z IPA i 85 pacjentów z CAP bez IPA. Zbadano związek między różnymi mikrobiomami a danymi klinicznymi dla wszystkich 109 pacjentów z PZP. W przypadku różnorodności alfa nie było znaczących różnic w indeksie Shannona i indeksie Simpsona mikroflory u pacjentów z IPA i pacjentami z CAP bez IPA, co pokazuje, że różnorodność społeczności w próbie była podobna między pacjentami z IPA i pacjentami bez IPA.

W przypadku różnorodności beta nasze wyniki wykazały dramatyczną różnicę w ważonej odległości UniFrac (p=2,1 × 10-6) i odległości Braya-Curtisa (p=0,033) między IPA a nie-IPA Pacjenci z PZP, wskazujący na potencjalny wpływ Aspergillus spp na strukturę mikroflory płucnej u pacjentów z rozpoznaniem IPA. Podobne badania wykazały znaczące różnice w różnorodności beta mikroflory między IPA a grupą kontrolną.11 Może to być spowodowane tym, że czynniki sprawcze w grupie kontrolnej były złożone i mogą to być dowolne patogeny CAP (takie jak bakterie, wirusy, grzyby, pasożyty, a nawet atypowe patogeny) z wyjątkiem Aspergillus. Zatem heterogeniczność drobnoustrojów w płucach w kontroli była wyższa niż w przypadku IPA. Tymczasem badania te wykazały, że Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria i Bacteroidetes były najliczniejszymi gromadami w kohorcie IPA.11 Jednak poza bakteriami, nasze badanie wykazało, że względna obfitość Ascomycota była również wysoka na poziomie gromady, na przykład metagenomika może zebrać prawie cały kwas nukleinowy mikroflory, w tym bakterie, grzyby, wirusy i pasożyty.

Znacząco różne gatunki, w szczególności S. salivarius, P. Sinensis i H. betaherpesvirus 5, były silnie powiązane z danymi klinicznymi. S. salivarius i P. timonensis były pozytywnie powiązane z biomarkerami laboratoryjnymi, takimi jak limfocyty T, i ujemnie związane z wynikami klinicznymi, takimi jak śmiertelność szpitalna. Podczas gdy H. betaherpeswirus 5 był ujemnie skorelowany z biomarkerami laboratoryjnymi, takimi jak limfocyty T, i dodatnio skorelowany z wynikami klinicznymi, takimi jak śmiertelność szpitalna. Wcześniejsze badania wykazały, że S. salivarius jest bakterią probiotyczną, która może hamować przyleganie pneumokoków do komórek nabłonka gardła.31 Inne badanie wykazało również, że izolaty S. salivarius mają lepszą zdolność hamowania wzrostu Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes i Staphylococcus aureus. 32 Wszystkie te badania zbiegły się z naszym badaniem, w którym S. salivarius był dodatnio skorelowany z lepszym wynikiem klinicznym pacjentów.

Możliwy mechanizm S. salivarius dodatnio skorelowany z poprawą wyników pacjentów może polegać na hamowaniu wzrostu potencjalnego patogenu i aktywacji układu odpornościowego gospodarza. W przypadku P. Sinensis poprzednie badanie wykazało, że P. timonensis może radykalnie indukować ekspresję mucyn związanych z błoną w trójwymiarowym modelu komórek nabłonka endometrium i tworzyć biofilm na powierzchni nabłonka, co z kolei wpływa na adhezję innych bakterii .33 Przyczyną pozytywnej korelacji z lepszym wynikiem klinicznym pacjentów może być odporność na kolonizację P. Sinensis w płucach i aktywacja układu odpornościowego gospodarza. W warunkach klinicznych H. betaherpeswirus 5 może wywoływać trwające całe życie utajone infekcje u zdrowych ludzi. Jednak po obniżeniu odporności H. betaherpeswirus 5 może zostać reaktywowany, na przykład biorcy narządów miąższowych i pacjenci zakażeni wirusem HIV.34 Tak więc reaktywacja H. betaherpeswirusa 5 wskazuje na osłabiony układ odpornościowy i złe wyniki kliniczne pacjentów z IPA .

Nasze badanie ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, badanie retrospektywne miało na celu analizę zebranych danych i było ograniczone do stosunkowo małej liczebności próby, co mogło predysponować je do wprowadzenia błędu wynikającego z niepełnych informacji. Po drugie, było to badanie obserwacyjne. Chociaż znaleźliśmy kilka interesujących korelacji między mikroflorą płuc a danymi klinicznymi, związek przyczynowy musi zostać rozwiązany za pomocą prospektywnego badania kohortowego lub eksperymentu mechanizmu, takiego jak eksperyment na zwierzętach, który będzie kolejnym etapem naszych badań. W przeciwnym razie w badaniu zidentyfikowano pacjentów z prawdopodobną infekcją Aspergillus ściśle w oparciu o nowe kryteria diagnostyczne EORTIC/MSG 2019, więc kilka przypadków nie mogło spełnić kryteriów prawdopodobnej diagnozy IPA ze względu na brak klasycznych czynników gospodarza.

Współtwórcy

Koncepcja i projekt badania: YL, ZA i HX. Akwizycja danych: ZA, ML, HL i MD. Analiza i interpretacja danych: ZA i HX. Redakcja manuskryptu: ZA, HX i YL. Krytyczna wersja manuskryptu pod kątem ważnych treści intelektualnych: HX, ZA i YL. Analiza statystyczna: ZA, HL i HX. Wsparcie administracyjne, techniczne lub rzeczowe: HX, HL i YL. Wszyscy autorzy przyczynili się do powstania artykułu i zatwierdzili przesłaną wersję.

Finansowanie

Projekt medycznych badań naukowych w Chongqing (wspólny projekt Chongqing Health Commission oraz Science and Technology Bureau (2022GDRC010)).

Konkurujące interesy

Żaden nie został zadeklarowany.

Zaangażowanie pacjentów i społeczeństwa

Pacjenci i/lub opinia publiczna nie byli zaangażowani w planowanie, prowadzenie, raportowanie ani plany rozpowszechniania tych badań.

Zgoda pacjenta na publikację

Nie dotyczy.

Zgoda etyczna

W tym badaniu biorą udział ludzie. To badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyczną First Affiliated Hospital of Chongqing Medical Hospital (numer zatwierdzenia 2021-301). Uczestnicy wyrazili świadomą zgodę na udział w badaniu przed wzięciem w nim udziału.

Pochodzenie i przegląd równorzędny

Nie zlecone; recenzowane z zewnątrz.

Oświadczenie o dostępności danych

Wszystkie dane istotne dla badania są zawarte w artykule lub przesłane jako dodatkowe informacje online.

Materiał uzupełniający

Ta treść została dostarczona przez autora(ów). Nie został zweryfikowany przez BMJ Publishing Group Limited (BMJ) i mógł nie być recenzowany. Wszelkie omawiane opinie lub zalecenia są wyłącznie opiniami autora(ów) i nie są popierane przez BMJ. BMJ zrzeka się wszelkiej odpowiedzialności wynikającej z polegania na treści. Jeśli treść zawiera jakiekolwiek przetłumaczone materiały, BMJ nie gwarantuje dokładności i wiarygodności tłumaczeń (w tym między innymi lokalnych przepisów, wytycznych klinicznych, terminologii, nazw leków i dawek leków) i nie ponosi odpowiedzialności za jakiekolwiek błędy i/ lub pominięcia wynikające z tłumaczenia i adaptacji lub w inny sposób.

Otwarty dostęp

To jest artykuł o otwartym dostępie rozpowszechniany na licencji Creative Commons Attribution Non-Commercial (CC BY-NC 4.0), która pozwala innym na dystrybucję, remiksowanie, adaptację i tworzenie na podstawie tej pracy w sposób niekomercyjny oraz udzielać licencji na swoje prace pochodne na innych warunkach, pod warunkiem, że oryginalne dzieło jest odpowiednio cytowane, odpowiednio podane, wszelkie wprowadzone zmiany są wskazane, a wykorzystanie nie jest komercyjne. Zobacz http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/.

BIBLIOGRAFIA

1 Taccone FS, Van den Abeele AM, Bulpa P i in. Epidemiologia inwazyjnej aspergilozy u krytycznie chorych pacjentów: obraz kliniczny, podstawowe warunki i wyniki. Crit Care 2015;19:7.

2 Danion F, Rouzaud C, Duréault A i in. Dlaczego tak wiele przypadków inwazyjnej aspergilozy jest pomijanych? Mykologia medyczna 2019;57:S94–103.

3 Donnelly JP, Chen SC, Kauffman CA i in. Przegląd i aktualizacja uzgodnionych definicji inwazyjnej choroby grzybiczej opracowanej przez Europejską Organizację Badań i Leczenia Raka oraz Konsorcjum Edukacyjno-Badawczego Mycoses Study Group. Clin Infect Dis 2020;71:1367–76.

4 Loughlin L, Hellyer TP, White PL i in. Aspergiloza płucna u pacjentów z podejrzeniem zapalenia płuc związanego z respiratorem na oddziałach intensywnej terapii w Wielkiej Brytanii. Am J Respir Crit Care Med 2020;202:1125–32.

5 Hage CA, Carmona EM, Evans SE i in. Streszczenie dla klinicystów: laboratoryjne badania mikrobiologiczne w diagnostyce zakażeń grzybiczych w praktyce pulmonologicznej i intensywnej terapii. Roczniki ATS 2019;16:1473–7.

6 Mitchell SL, Simner PJ. Sekwencjonowanie nowej generacji w mikrobiologii klinicznej: czy już tam jesteśmy? Clin Lab Med 2019;39:405–18.

7 Liu X, Chen Y, Ouyang H i in. Rozpoznanie gruźlicy za pomocą metagenomicznego sekwencjonowania nowej generacji na płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego: analiza przekrojowa. Int J Infect Dis 2021;104:50–7.

8 Sun T, Wu X, Cai Y i in. Metagenomiczne sekwencjonowanie nowej generacji do diagnostyki patogenów i leczenia antybiotykami ciężkiego pozaszpitalnego zapalenia płuc u dorosłych z obniżoną odpornością. Mikrobiol zakażający komórki przednie 2021;11:661589.

9 Ding L, Liu Y, Wu X i in. Metagenomika patogenów ujawnia różne sygnatury mikroflory płucnej między bakteriologicznie potwierdzonymi i negatywnymi pacjentami z gruźlicą. Mikrobiol zakażający komórki przednie 2021;11:708827.

10 Dickson RP, Schultz MJ, van der Poll T, et al. Mikrobiota płuc przewiduje wyniki kliniczne u pacjentów w stanie krytycznym. Am J Respir Crit Care Med 2020;201:555–63.

11 Hérivaux A, Willis JR, Mercier T i in. Mikrobiota płuc przewiduje inwazyjną aspergilozę płucną i jej wynik u pacjentów z obniżoną odpornością. Klatka piersiowa 2022;77:283–91.

12 Mandell LA, Wunderink RG, Anzueto A i in. Amerykańskie Towarzystwo Chorób Zakaźnych/Amerykańskie Towarzystwo Chorób Zakaźnych wytyczne dotyczące postępowania w pozaszpitalnym zapaleniu płuc u dorosłych. Clin Infect Dis 2007;44 Suppl 2:S27–72.

13 Wang Y, Fan G, Horby P i in. Porównawcze wyniki dorosłych hospitalizowanych z powodu zakażenia wirusem grypy sezonowej A lub B: zastosowanie skali porządkowej 7-kategorii. Otwórz forum Infect Dis 2019;6:ofz053.

14 Chen X, Ding S, Lei C i in. Metagenomiczne sekwencjonowanie nowej generacji krwi i płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego w zapaleniu płuc. Can J Infect Dis Med Microbiol 2020;2020:6839103.

15 Long Y, Zhang Y, Gong Y i in. Diagnoza sepsy za pomocą DNA bezkomórkowego za pomocą technologii sekwencjonowania nowej generacji u pacjentów na OIOM-ie. Arch Med Res 2016;47:365–71.

For more information:1950477648nn@gmail.com