Wysoki P16INK4a, marker starzenia komórkowego, jest związany z uszkodzeniem nerek, upośledzeniem i wynikiem w toczniowym zapaleniu nerek

edmund.chen@wecistanche.com

CISTANCHE POPRAWI CHOROBY NEREK/NEREK

WPROWADZANIEToczniowe zapalenie nerek (LN) jest poważnym powikłaniem tocznia rumieniowatego układowego (SLE), zapoczątkowanym przez odkładanie się kompleksów immunologicznych lub autoprzeciwciał w błonie podstawnej kłębuszków, a następnie rekrutację komórek zapalnych”.Uraz nerekprowadzi do nieodwracalnego zwłóknienia, co prowadzi do utraty funkcji nerek. LN jest leczona wysokimi dawkami kortykosteroidów i innych środków immunosupresyjnych. Jedna trzecia pacjentów wykazuje jednak spadek wczynność nerek, gdzie 5 procent -10 procent rozwija końcową fazęchoroba nerekw ciągu 10 lat. W związku z tym chętnie poszukuje się markerów prognostycznych, które pozwolą na eskalację lub modyfikację leczenia w odpowiednim czasie, podobnie jak nowe cele terapeutyczne. zatrzymanie poprzez akumulację inhibitorów kinazy zależnej od cyklin (CDK), w tym białka pl6Na (CDKN2A): główna cecha nauki o cellsenes.Starzejące się komórki pozostają metabolicznie aktywne i przechodzą szereg zmian morfologicznych i fizjologicznych, w tym zwiększenie aktywności i akwizycji -galaktozydazy prozapalnego, profibrotycznego fenotypu sekrecyjnego związanego ze starzeniem się (SASP)." Chociaż proces ten jest niezbędny w naprawie i przebudowie tkanek (np. podczas embriogenezy), starzenie się komórek może wywierać niekorzystne skutki w chorobach przewlekłych i związanych ze starzeniem się, a także w nowotworach”. komórki p16Nk lub -galaktozydazo-dodatnie zaobserwowano wnerkowystarzeniem się i niektórymi chorobami nerek oraz były związane ze zmianami histologicznymi inerkowyosłabienie. Obecność komórek dodatnich pod względem galaktozydazy korelowała z białkomoczem u myszy podatnych na MRL/Iprlupus; jednakże starzenie się komórek nie zostało jeszcze wyraźnie wykazane w LN dodatnim. Tutaj zgłaszamy wystąpienie pl6ka. komórki w biopsjach nerki od (n=40) pacjentów z aktywną LN i ich związek zuszkodzenie nereki upośledzenie funkcji.

Słowa kluczowe:funkcja nerki; choroby nerek; biopsje nerek; uszkodzenie nerek; nerkowy

CISTANCHE POPRAWI DIALIZACJĘ NEREK/NEREK

METODY:Pacjenci i biopsje nerekPacjenci byli rekrutowani w Klinice Reumatologii Cliniques Universitaires Saint-Luc (Bruksela, Belgia). Wszyscy spełnili zaktualizowane kryteria klasyfikacji ACR z 1982 r. dla SLE i mieli LN potwierdzoną biopsją. Biopsje nerki utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie (FFPE) były pozostałością materiału ciała pobranego do celów diagnostycznych w okresie od stycznia 1996 r. do listopada 2019 r. Szacunkowe wartości współczynnika filtracji kłębuszkowej (eGFR) obliczono przy użyciu formuły Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration (CKD-EPI). Zgoda pacjenta nie była wymagana w przypadku wykorzystania pozostałości materiału cielesnego, zgodnie z belgijskimi przepisami dotyczącymi badań na ludziach.

Histologia i immunohistochemiaKlasyfikacja SLE ISN/RPS 2003nerkowybiopsje, półilościowe wyniki stwardnienia oraz indeks aktywności (AI) i przewlekłości (C) National Institutes of Health (NH) zostały pobrane z dokumentacji medycznej. Trening immunologiczny z barwieniem anty-CD8 (C8/144B, Dako) i anty-p16INK4 (E6H4, Roche Ventana CINtec Histology) oraz barwieniem Picrosirius Red （PSR） przeprowadzono na 5 μm seryjnych przekrojach FFPE. Slajdy digitalizowano na skanerze SCN400 (Leica Biosystems, Niemcy) lub skanerze Pannoramic Confocal (3DHistech, Węgry) przy powiększeniu x 20. Wspomaganą komputerowo kwantyfikację całej powierzchni przekrojów przeprowadzono przy użyciu autora V2017.2 (Visi Biopharm, Dania). Przedstawione wyniki to liczba komórek dodatnich pod względem p16K lub CD8-na μm² tkanki. Półilościowe wyniki PSR (skala: 2-6) to mediana (zwłóknienie kłębuszkowe plus śródmiąższowe) od trzech (zaślepionych) punktacji. Dalsze szczegóły znajdują się w dodatkowych metodach online 1, uzupełniający rysunek online 1.Analizy statystyczneAnalizy statystyczne przeprowadzono w programie GraphPad Prism V.9.1.0: testy par Manna-Whitneya lub Wilcoxona z rangą znakowanych dopasowanych par dla porównań dwugrupowych, Kruskala-Wallisa dla porównań wielogrupowych oraz współczynnik korelacji rang Spearmana.

WYNIKI:p16k4-dodatnie komórki w biopsjach nerki od pacjentów z aktywnym LNOceniliśmy białko p16Nk metodą immunohistochemiczną nanerkowybiopsje pobrane w momencie rozpoznania od 40 pacjentów z aktywną LN, w tym incydentalne zapalenie nerek (n=31) i nawrót (n=9). Dane demograficzne, biologiczne i kliniczne podsumowano w internetowej tabeli uzupełniającej 1.p16INkA. dodatnie komórki wykryto we wszystkich, ale ze znaczną zmiennością między próbkami: od praktycznie żadnych do sporadycznie rozproszonych komórek, do silnie dodatnich obszarów (rysunek 1A, uzupełniający rysunek online 2A-D). Ocena ilościowa barwienia p16 potwierdziła niejednorodność biopsji LN (zakres: 1,76×10~-260×10~,mediana: 14,7×10-komórek/μm）（rysunek 1B,C）. Barwione komórki obejmowały komórki mezangialne, komórki śródbłonka lub podocyty w kłębuszkach, komórki nabłonka ciemieniowego w torebkach Bowmana, komórki kanalików proksymalnych lub dystalnych oraz komórki śródmiąższowe (rysunek ID). Chociaż gęstość komórek p6-dodatnich（na μm） była znacznie wyższa w kłębuszkach niż w śródmiąższach (ryc. 1C), wartości te (na próbkę) wykazały istotną dodatnią korelację (r=0.7591, p<0.0001)(online supplemental="" figure="" 3).="" importantly,="" pl6ka="" accumulation="" was="" not="" associated="" with="" patient="" age,="" gender,="" or="" ethnicity="" (online="" supplemental="" figure="">

CISTANCHE POPRAWI INFEKCJE NEREK/NEREK

p16"K4 jest związany z niewydolnością nerek na początku i 5 lat po leczeniuPozytywność p16INKEa była istotnie związana z upośledzeniemczynność nerek: biopsje od pacjentów z eGFR<60 at="" the="" time="" of="" sampling="" had="" significantly="" higher="" pl6inf-positive="" cells/μm²,="" and="" conversely,="" samples="" with="" high(="">75 percentyl) p16a były związane ze znacznie niższym wyjściowym eGFR (rysunek 2AB). Związek z eGFR był prawdziwy zarówno dla kłębuszkowego, jak i śródmiąższowego p16a (dodatkowy rysunek online 5A, B). Co ciekawe, podczas gdy wysokie kłębuszkowe p16 było również związane ze znacznie wyższym białkomoczem (stosunek białka w moczu do kreatyniny), co odzwierciedla głównie efekt glamour-nie (uszkodzenie naczyniówkowe online, śródmiąższowa figura pl6ka w umyśle 5C, D). W przeciwieństwie do jej kojarzenia nie było kojarzone z biednymiczynność nerekpl6NK4a parametry choroby ogólnoustrojowej, takie jak poziomy przeciwciał przeciw dwuniciowemu DNA w surowicy lub poziomy C3, lub z klasyfikacją ISN/RPS (dodatkowy rysunek online 6A-D). Nieco (nieistotnie) wyższy p16k był obserwowany w biopsjach od pacjentów z dłuższym czasem trwania między diagnozą SLE i LN iw nawrocie porównanym z przypadkowym zapaleniem nerek (online dodatkowa figura 7A,B). Co ważne, analiza tylko przypadkowych przypadków LN potwierdziła związek między p16 i eGFR (dodatkowa figura 7C online), sugerując, że nie zależy to wyłącznie od czasu trwania choroby nerek. Wreszcie, wysokie p16Nkia w początkowych biopsjach było również związane z niższym eGFR w ciągu 5 lat po leczeniu (ale nie w roku), co sugeruje, że może to być predyktorem złego długoterminowegonerkowyewolucja (rysunek 2C,D).

Figura 1 p16NK43-komórki dodatnie w biopsjach nerki od pacjentów z aktywnym barwieniem LN.(A) p16, CD8 i PSR seryjnych skrawków FFPE z wyjściowej biopsji nerki LN. Przegląd (lewe panele), zbliżenie (po prawej) pokazujące komórki dodatnie pod względem p16 w kłębku nerkowym, okołokłębuszkowe komórki CD8-dodatnie oraz złogi kolagenu wi wokół torebki Bowmana tego samego kłębuszka. (B) Kwantyfikacja p16xa （komórek dodatnich/μm² pokazująca stopień niejednorodności między próbkami. （C） Kwantyfikacja p16< （positive="" cells/um²）="" in="" glomerular="" vs="" interstitial="" areas="" of="" the="" same="" samples.p-value:="" wilcoxon="" matched-pair="" signed-rank="" test.="" (d)="" representative="" image="" from="" a="" sample="" showing="" p16-positive="" cells="" within="" glomeruli="" (#),="" in="" bowman's="" capsules="" (filled="" star),="" proximal="" tubules(filled="" arrow),="" distal="" tubules(arrow)="" and="" dispersed="" in="" the="" interstitium="" (arrowhead).ffpe,="" formalin-fixed="" paraffin-embedded;="" ln,="" lupus="" nephritis;="" psr,="" picrosirius="">

p16NK43 jest związany z naciekiem limfocytów T CD8* w nerkach i zwłóknieniem p16MaWykazano, że limfocyty CD8tT są dominującym typem komórek odpornościowych naciekających nerkę LN i że ich obecność jest związana zchoroba nerekciężkość Odkryliśmy, że biopsje p6-high wykazywały znacznie wyższą infiltrację limfocytów T CD8t (rysunek 3A). Były również istotnie związane ze zwiększonym zwłóknieniem: kolagen

odkładanie odzwierciedlone przez półilościowe wyniki barwienia PSR oraz oceny stwardnienia i NH CI dostarczone przez neuropatologa (figura 3B-D). Natomiast wyniki NIH AI nie różniły się istotnie między grupami p16INK4as (dane nieprzedstawione). Co ciekawe, podczas badania skrawków tkanek zauważyliśmy, jak się wydawało, przestrzenny współdystrybucja między silnym barwieniem p16k (które miało tendencję do kłębuszkowego) a skupionymi komórkami CD8-dodatnimi (najczęściej okołokłębuszkowe) w niektórych biopsjach LN (rysunek IA, uzupełniający rysunek online 2). My zatem. określili ilościowo liczbę limfocytów T CD8* zlokalizowanych w promieniu 30 μm wokół każdego kłębuszka, grubość jego torebki Bowmana i liczbę komórek pl6k-dodatnich w niej (dodatkowy rysunek online 1). Dokonano tego na wszystkich kłębuszkach widocznych na trzech przekrojach seryjnych, we wszystkich próbkach. Kłębuszki z wysoką akumulacją komórek p16K4-dodatnich wykazywały znacznie wyższą liczbę limfocytów T CD8 Perigo-plamki (figura 3E), jak również zwiększoną grubość torebek Bowmana, odzwierciedlając zwłóknienie kłębuszków (figura 3F).

DYSKUSJAJest to pierwsze wykazanie w dużej grupie pacjentów, że p16Na, główna cecha starzenia komórkowego, jest związana z nasileniem choroby w LN. IHC dla białka pl16 jest szeroko stosowane do oceny starzenia ex vivo i jest związane z nasileniem innychnerkowyChoroby. „Wykazano ponadto, że selektywna eliminacja komórek pl6-dodatnich w mysich modelach starzenia i indukowanej nefropatii łagodzi zmiany zwłóknieniowe i poprawiaczynność nerek”, sugerując kluczową rolę wnerkowypatogeneza. Nie wiadomo, dlaczego w LN może wystąpić starzenie się komórek. Zapalne, oksydacyjne środowisko nerki LN może być źródłem stresu komórkowego. Kilka czynników prozapalnych jest zaangażowanych w indukcję starzenia,14 w tym interferon-B3, który został powiązany z fenotypem starzenia mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego od pacjentów z SLE15Chociaż nasze badanie podkreśla istotny związek między obfitością komórek p6-dodatnich a nasileniem LN, zastosowanie dodatkowych markerów starzenia się komórek w większej kohorcie będzie kluczowe dla potwierdzenia ich znaczenia w przypadku LN. Czy iw jaki sposób starzenie się komórek przyczynia się do postępu choroby (lub czy po prostu odzwierciedla uszkodzenie tkanki) pozostaje do zbadania. Szkodliwy efekt może być wywierany przez profibrotyczny, prozapalny sekretom (SASP) typowy dla starzejących się komórek. Zgodnie z tą hipotezą, opisujemy ścisłą przestrzenną współdystrybucję między komórkami p16Nk-dodatnimi, zwłóknieniem i naciekiem limfocytów T CD8* w nerkach LN. Innym mechanizmem patogenetycznym może być akumulacja niesprawnych funkcjonalnie komórek, np.nerkowykomórki progenitorowe (RPC, podzbiór komórek nabłonkowych okładzinowych zlokalizowanych w torebce Bowmana w kłębuszkach).'" Podczas gdy zdrowe RPC regenerują struktury kłębuszkowe i kanalikowe dzięki ich zdolności do proliferacji i różnicowania się wnerkowypodzbiorów komórek „starzejące się RPC mogą utrudniać naprawę tkanek”. Wreszcie, podczas gdy SASP jest szczególnie przystosowany do angażowania układu odpornościowego (w tym limfocytów T CD8t)”8 w celu usuwania starzejących się komórek, ten ostatni może zakłócić proces poprzez hamowanie komórki cytolityczne”. Sugeruje się, że utrzymywanie się starzejących się komórek (ze względu na przytłaczającą lub zahamowaną odpowiedź immunologiczną) przechyla równowagę z pozytywnego na negatywny wpływ. rola komórek p16Nk-dodatnich w patogenezie LN. Może to mieć ważne implikacje dla terapii, pierwszego otwartego badania pilotażowego z użyciem leków senolitycznych dasatynibu i kwercetyny (DQ), które wykazały obiecujące wyniki w idiopatycznym zwłóknieniu płuc i cukrzycowej chorobie nerek.Wreszcie związek wysokiego poziomu wyjściowego p16INk4 z upośledzonymczynność nerek5 lat po rozpoczęciu leczenia sugeruje, że może to być obiecujący predyktor ciężkości choroby. Interesująca byłaby ocena p16 i związanych z nim markerów (zwłóknienie i naciek limfocytów T CD8) w 1-rocznych biopsjach kontrolnych, jak również w większej kohorcie, ponieważ ewolucja tych markerów od wartości wyjściowych do Rok może lepiej odzwierciedlać odpowiedź na leczenie niż każdy punkt czasowy osobno.