Komórki z interkalacją nerek są fagocytarne i zakwaszają zinternalizowane uropatogenne Escherichia coli

edmund.chen@wecistanche.com

Nerkainterkalowane komórki biorą udział w homeostazie kwasowo-zasadowej poprzez ekspresję wakuolowej ATPazy. Przedstawiamy tutaj sześć ludzkich interkalowanych podtypów komórek, w tym hybrydowe główne interkalowane komórki zidentyfikowane na podstawie transkryptomiki pojedynczej komórki. Dojrzewanie fagosomów to proces biologiczny, który wzrasta w analizie szlaku biologicznego po ekspozycji na uropatogenne Escherichia coli w dwóch interkalowanych podtypach komórek. Wizualizacja mysiego mikroskopu konfokalnego w czasie rzeczywistymnerkowykanaliki perfundowane zielonym fluorescencyjnym białkiem wyrażającym Escherichia coli lub pHrodo Green E. coli BioParticles pokazują, że wstawione komórki aktywnie fagocytują bakterie, a następnie zakwaszają fagolizosomy. Dodatkowo, interkalowane komórki wykazują zwiększoną ekspresję ATPazy w wakuolach po doświadczalnym UTI in vivo. Podsumowując, interkalowane komórki wykazują odpowiedź transkrypcyjną sprzyjającąnerkowyobrony, pochłaniania bakterii i zakwaszania zinternalizowanych bakterii. Komórki interkalowane reprezentują komórkę nabłonkową o cechach profesjonalnych fagocytów, takich jak makrofagi.

Słowa kluczowe:choroba nerek; tkanka nerki; komórki nerki; nerka; nerkowy

Kanalik gromadzący nerki jest końcowym miejscem regulacji kwasowo-zasadowej 1 . Kanał zbiorczy składa się z komórek głównych i komórek interkalowanych (IC). Główne komórki (PC) pośredniczą w resorpcji soli i wody i charakteryzują się cytoplazmatyczną akwaporyną 2 (AQP2) 2 . IC pomagają utrzymać homeostazę kwasowo-zasadową i mają trzy opisane podtypy: typ A (A-IC), typ B (B-IC) i nonA-nonB 2,3 . A-IC wydzielają protony przez wierzchołkową H-ATPazę wakuolową (V-ATPaza) i regenerują wodorowęglany za pomocą transportera chlorek/wodorowęglan zasadowy (Cl − /HCO 3 ), wymiana anionów 1 (AE1/pasmo 3/SLC4A1) 1,4 . B-IC wydzielają HCO 3 - przez wierzchołkowy transporter Cl - /HCO 3, pendrynę (SLC26A4) i wyrażają podstawno-boczną V-ATPazę 2,3. IC gryzoni nonA–nonB zawierają pendrynę wierzchołkową i V-ATPazę, ale nie mają AE1 i zostały zidentyfikowane w przewodzie zbiorczym i kanaliku łączącym (CNT) 3 . Coraz więcej dowodów potwierdza wrodzoną rolę immunologiczną IC wraz z ich tradycyjną funkcją regulacji pH. Po pierwsze, większość z dziesięciu niespokrewnionych pacjentów z dystalnąnerkowyDonoszono, że kwasica kanalikowa, stan charakteryzujący się dysfunkcją IC, miała historię ZUM 5 . Po drugie, uropatogenna Escherichia coli (UPEC), organizm wyizolowany w 70 procentach ostrego odmiedniczkowego zapalenia nerek u mężczyzn i 80 procent u kobiet, lokalizuje się selektywnie w cytoplazmie IC6,7. Po trzecie, zidentyfikowaliśmy, że IC wyrażają peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP), takie jak rybonukleaza 7 (RNASE7) 8–11. Te AMP mają bezpośrednią aktywność przeciwko wielu patogenom, w tym bakteriom, na początku i/lub w odpowiedzi na infekcję 8-11 . Po czwarte, my i inni niezależnie donosiliśmy, że myszy z nieprawidłowym rozwojem IC mają zwiększoną podatność na infekcje dróg moczowych (ZUM) i/lub odmiedniczkowe zapalenie nerek12,13. Po piąte, IC zarówno wyczuwają, jak i pośredniczą w zapaleniu 14 . Na koniec wykazaliśmy ekspresję genów wrodzonej odporności w izolowanych mysich IC 15,16

CISTANCHE POPRAWI CZYNNOŚĆ NEREK/NEREK

Zrozumienie, w jaki sposób IC chronią drogi moczowe przed infekcją, jest ważne, ponieważ ZUM są często spotykane. Ponad 50 procent kobiet doświadcza ZUM w ciągu swojego życia, a ZUM stanowią 1–6 procent wszystkich wizyt lekarskich 17 . Kiedy bakterie wznoszą się donerkipowodujące odmiedniczkowe zapalenie nerek, potencjalne powikłania obejmują nadciśnienie, przewlekłechoroba nerek, i urosepsy 18,19 . Szacuje się, że rocznie w Stanach Zjednoczonych występuje 250000 przypadków odmiedniczkowego zapalenia nerek 17 . Oporność wielolekowa staje się krytycznym wyzwaniem w leczeniu ZUM i innych infekcji 20 . Dlatego mechanizmy IC używane do obrony przed wstępującym uropatogenami mogą być celami terapeutycznymi, które można wykorzystać do rozwojunerka-specyficzna terapia odmiedniczkowego zapalenia nerek. Ponieważ większość badań dotyczących IC obejmuje modele zwierzęce, potrzebne będzie lepsze zrozumienie ludzkich IC, aby pokierować podstawowymi badaniami naukowymi w kierunku lepszej opieki klinicznej.

Ponieważnerkajest złożonym narządem, profile mRNA mogą być trudne do interpretacji. Na przykład nefron ma specjalizację regionalną z odrębnymi segmentami kanalików i podtypami komórek. Thenerkazawiera komórki śródbłonkowe, nabłonkowe, śródmiąższowe i zrekrutowane komórki zapalne, wszystkie o odrębnych funkcjach biologicznych i wzorcach ekspresji genów. Sekwencjonowanie pojedynczych komórek RNA (scRNA-seq) reprezentuje szybko rozwijającą się metodologię identyfikacji i profilowania różnych typów komórek na początku lub w odpowiedzi na stresory 21 . Tutaj pokazujemy za pomocą technologii scRNA-seq, że człowieknerkaUkłady scalone składają się z sześciu różnych podzbiorów, które obejmują trzy układy A-IC, jeden hybrydowy IC-PC, jeden nonA-nonB IC i jeden B-IC. Analiza szybkości RNA wykazała przesunięcie transkrypcji z komputerów osobistych w kierunku podzbiorów A-IC po ekspozycji na UPEC. Analiza ścieżki pomysłowości ujawniła dojrzewanie fagosomów jako kluczowy szlak biologiczny w podzbiorze A-IC po ekspozycji na UPEC. W tej ścieżce V-ATPazy są kluczowymi zaangażowanymi składnikami. Zastosowaliśmy mikroskopię przyżyciową do wizualizacji in vivo wychwytu UPEC przez IC i potwierdziliśmy zakwaszenie UPEC internalizowanego w tych IC. Wreszcie, mysi model UTI wykazał wzrost ekspresji mRNA V-ATPazy (Atp6v1b1). Badania te zapewnią podstawę do zbadania i terapeutycznej manipulacji komórkami nabłonka wyrażającymi V-ATPazę jako fagocytami bakteryjnymi.

Wyniki

Ludzkie IC można wzbogacić metodą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) za pomocą kulek magnetycznych pokrytych receptorem czynnika wzrostu komórek tucznych (CD117/c-KIT). Człowieknerkatkanki, głównie z normalnych marginesównerkamasowych resekcji, pocięto na 2–4-mm kawałki, a następnie przewieziono przez noc do naszego laboratorium w Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) na lodzie przez Cooperative Human Tissue Network [https://www.chtn.org]. Oceniliśmy c-KIT jako marker powierzchniowy komórki do sortowania ludzkich układów scalonych, ponieważ c-KIT był z powodzeniem stosowany do tego celu u myszy22. Ekspresja c-KIT zlokalizowana w ludzkich IC w oparciu o odkrycie, że c-KIT i ludzki marker IC V-ATPaza, podjednostka B1 (gen ATP6V1B1), wspólnie znakowały te same komórki w ludzkimnerkasekcja (rysunek uzupełniający 1) 22,23 . Po sortowaniu magnetycznym, które obejmowało usunięcie CD45 plus komórki odpornościowe i martwe komórki; wzbogacenie domniemanych ICs c-KIT-dodatnich zostało wykazane przez ekspresję mRNA ATP6V1B1, która wzrosła 8–12-krotnie w komórkach c-Kit-dodatnich w porównaniu z komórkami c-KIT-ujemnymi. Zarówno SLC4A1, jak i SLC26A4 były zmiennie wzbogacane w IC, co pokazuje, że zarówno wzbogacenie A-IC i/lub B-IC jest możliwe przy użyciu tej metodologii (rysunek uzupełniający 2). Tło tkanki nerkowej użytej w tym badaniu przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej 1.

Zintegrowana analiza skupień zidentyfikowała sześć podtypów IC.Sekwencja ScRNA została ukończona w 1861 zdysocjowananerkakomórki, które zostały wzbogacone w IC, jak opisano powyżej. Wzbogacone układy scalone uzyskano z normalnych marginesów pojedynczegonerkamasowa resekcja. Filtrowanie kontroli jakości (QC) przeszło przez 859 komórek wystawionych na działanie UPEC in vitro przez 1 godzinę i 1002 komórek wystawionych na działanie soli fizjologicznej in vitro przez 1 godzinę. Analiza funkcji Seurata zidentyfikowała 12 klastrów w posortowanym preparacie komórkowym (ryc. 1a). Dziewięć najbardziej konserwatywnych markerów w każdym skupieniu przedstawiono na rysunkach uzupełniających. 3-14. Ogólnie podtypy IC stanowiły 1066 (57%) z 1861 komórek. Sześć klastrów reprezentowało podtypy IC. W szczególności znaleźliśmy trzy podtypy A-IC, jeden B-IC, jeden nonA-nonB-IC i jeden hybrydowy podtyp (y) PC-IC.Nerkanomenklatura komórek nabłonkowych zalecana przez Chen i współpracowników, konserwatywnych markerów, które były wcześniej zgłaszane jako markery typu komórkowego lub konserwatywnych markerów, które odróżniały jeden z 12 skupień od innych, użyto do przypisania typu komórki do każdego skupienia (tabela uzupełniająca 2 , ryc. 1b, c, ryc. 2) 24-28 .

Podtyp A-IC i ekspresja białka hybrydowego PC-IC są skorelowane z wynikami sekwencji scRNA. Zwalidowaliśmy kluczowe ustalenia scRNA-seq, w szczególności to, że SLC8A1 (określany również jako Na plus/Ca plus wymiennik 1 (NCX1)) jest markerem hybrydowych PC–IC i że członek 1A rodziny białek szoku termicznego A (Hsp70) (HSPA1A) wraz z odpowiedzią wczesnego wzrostu 1 (EGR1) są markerami, które mogą różnicować podtypy A-IC (ryc. 3). Ponieważ użyliśmy normalnych marginesównerkaresekcji raka, potwierdziliśmy, że nasze SLC8A1, HSPA1A i EGR1nerkawzorce ekspresji były zgodne z obserwowanymi w normalnymnerkatkanki z Atlasu białek ludzkich dostępnego na stronie http://www.proteinatlas.org (ryc. uzupełniający 15) 29

Zbieranie profili markerów podtypów komórek kanalików wykazanych wcześniej u myszynerkakomórki pozostają w dużej mierze nienaruszone u człowiekanerkakomórki. Ponieważ ważne będzie kontekstualizowanie wyników przyszłych mysich modeli w ludzkiej patofizjologii, oceniliśmy ekspresję ludzkich IC mysich markerów komórek przewodowych zbierających, zidentyfikowanych wcześniej w badaniach scRNA-seq przeprowadzonych przez Chen i in. 22 oraz Ransick i in. 30 . Wykres punktowy wyników przedstawiono na ryc. 4. Markery typu mysich komórek przewodu pobierającego są w większości konserwowane w ludzkich komórkach przewodu zbiorczego.

Podtyp A-IC wzrasta we względnym procencie po 1 godzinie ekspozycji na UPEC. Odsetki komórek w klastrach były zgodne między typami ekspozycji z wyjątkiem podtypu A-IC A/klaster 0, który wzrósł z 16,2 do 20,1 procent i podtypu A-IC C/klaster 5, który zmniejszył się z 9,4 do 6,6 procent, przy ekspozycji na sól fizjologiczną w porównaniu z UPEC, P =00,03 (Tabela 1).

Hybrydowe komórki PC–IC zmieniają prędkość RNA z dala od komputerów PC w kierunku A-IC w odpowiedzi na 1 godzinę ekspozycji na UPEC. Względną obfitość niedawno transkrybowanych pre-mRNA niepodlegających splicingowi w porównaniu z dojrzałym mRNA poddanym splicingowi można wykorzystać do obliczenia zmiany w obfitości mRNA, określanej jako prędkość mRNA31. Dodatnia prędkość mRNA w badaniach pojedynczych komórek wskazuje, że geny są regulowane w górę, podczas gdy ujemna prędkość mRNA oznacza, że ​​geny są regulowane w dół 31 . Kierunek prędkości RNA wskazuje, że komórka ma trajektorię ekspresji mRNA w kierunku innego typu komórki 31,32. Szybkość mRNA w odpowiedzi na ekspozycję na UPEC jest przedstawiona na ryc. 5. Co ważne, hybrydowe PC–IC zmieniają prędkość RNA od PC do IC w odpowiedzi na UPEC. Ponadto IC utrzymują swoją aktywność transkrypcyjną, podczas gdy aktywność transkrypcyjna staje się minimalna u innychnerkatypy komórek.

Profil odporności wrodzonej nerek wykazuje pewne wczesne zmiany ekspresji pojedynczych komórek po 1 godzinie ekspozycji na UPEC.Wzory ekspresji scRNA-seq wybranych genów wrodzonej odporności po ekspozycji na UPEC w porównaniu z solą fizjologiczną przez 1 godzinę przedstawiono na rysunkach uzupełniających. 16 i 17. Kluczowe odkrycia obejmują wysoką ekspresję adrenomeduliny AMP (ADM) w podtypach A-IC A i B, hybrydowych PC-IC i B-IC. PC nie wykazują ekspresji adrenomeduliny na początku badania, ale mają znacznie zwiększoną ekspresję w odpowiedzi na ekspozycję na UPEC. Indukowane przez cytokiny białko SH2-zawierające białko (CISH) i ekspresję czynnika 1 bariery autointegracji (BANF1) jest znacząco indukowane w IC nie-A-non-B po ekspozycji na UPEC. Interleukina 18 (IL18), galektyna 3 (LGALS3), beta defensyna 1 (DEFB1) i przetwornik sygnału CD24 lipokalina 2/lipokalina neutrofilowa związana z żelatynazą (LCN2/NGAL) zostały zidentyfikowane tylko

w hybrydowych PC–IC i tylko minimalna ekspresja mRNA receptora Toll-like 4 była obecna. Nie zidentyfikowaliśmy ekspresji rybonukleazy 7 (RNASE7) na sekw. scRNA. Oceniliśmy ekspresję mRNA RNASE7 w sortowanych magnetycznie połączonych IC i nie-ICnerkakomórki. Ekspresja mRNA RNASE7 została zidentyfikowana w IC od jednego z czterechnerki(Rysunek uzupełniający 18).

Biologiczny proces dojrzewania fagosomów jest związany z IC wystawionymi na działanie UPEC przez 1 godzinę.Dziesięć wiodących ścieżek biologicznych powiązanych z każdym skupieniem zostało uszeregowanych według wartości p, jak określono za pomocą Analizy Ścieżek Pomysłowości. Trzy skupienia przypisane do przewodów zbiorczych A-IC podtyp A/skupienie 0, A-IC podtyp B/ skupisko 3 i A-IC podtyp C/klaster 5 miały różne procesy szlaku biologicznego po ekspozycji na UPEC w porównaniu z solą fizjologiczną (Ryc. 6a–c). Dojrzewanie fagosomów było najwyżej ocenianą funkcją w komórkach wystawionych na działanie UPEC i soli fizjologicznej w podtypie A-IC/klastra 5, przesunięte z drugiej na pierwszą pozycję w podtypie A-IC/klaster A-IC 0 i z czwartej na trzecią najwyższą pozycję w podtypie A-IC B/ skupisko 3. Żaden z pozostałych podtypów komórek przewodu zbiorczego (ryc. uzupełniający 19) nie miał dziesięciu głównych powiązanych szlaków, które różniły się po ekspozycji na UPEC w porównaniu z solą fizjologiczną. Profil ekspresji genów, który skutkował rankingiem dojrzewania fagosomów dla podtypu A-IC A/klaster 0 przedstawiono w tabeli uzupełniającej 3.

Ekspresja mRNA IC Atp6v1b1 wzrasta w odpowiedzi naeksperymentalne odmiedniczkowe zapalenie nerek in vivo.Szlak dojrzewania fagosomów Ingenuity uwydatnił udział V-ATPazy w układach IC (tabela uzupełniająca 3). Aby określić, czy V-ATPaza jest aktywowana po ekspozycji na UPEC, użyliśmy mysiego modelu ZUM. Godzinę po przezcewkowej inokulacji UPEC w porównaniu z solą fizjologiczną myszy „reporterowe IC”, które miały ekspresję tdTomato (tdT, wariant białka o czerwonej fluorescencji) w IC, zostały uśpione i IC zostały wzbogacone z dysocjacjikomórki nerkowe. Wzbogacone IC miały wyższą ekspresję mRNA Atp6v1b1 u myszy zaszczepionych UPEC w porównaniu z kontrolą z roztworem soli fizjologicznej (Fig. 6d).

ICs fagocytują UPEC in vivo.Opracowaliśmy metodologię perfuzji jednegonerkakanalik z UPEC w żywej myszy z nienaruszonąnerka.Agregaty UPEC z ekspresją zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) poddane mikroperfuzji do pojedynczego światła kanalików nerkowych myszy „reporterowych IC” wizualizowano przepływając przez kanaliki, selektywnie przylegając do powierzchni światła i ulegając internalizacji przez IC (Fig. 7) podczas mikroskopii przyżyciowej.

ICs zakwaszają fagolizosomy zawierające UPEC in vivo iin vitro.Przeprowadziliśmy również perfuzję kanalików biocząsteczkami pHrodo Green E. coli, które fluoryzują tylko po zakwaszeniu. Wychwyt i fluorescencję tych biocząstek uwidoczniono tylko podczas mikroskopii przyżyciowej w IC (ryc. 8). Analiza segmentacji Imaris wykazała, że ​​zielona fluorescencja znacząco wzrosła w czasie w tdT plus IC w 2 kanalikach perfundowanych biocząsteczkami pHrodo Green E. coli w porównaniu z kontrolnym kanalikiem tdT plus (ryc. 9a, b). Gdy fluorescencję oceniano na podstawie komórkowej, 12/16 (75%) komórek tdT plus wykazywało wzrost zielonej fluorescencji w czasie po perfuzji kanalikowej przy użyciu biocząsteczek pHrodo Green E. coli BioParticles (ryc. 9b). Wyniki regresji liniowej dla każdej komórki przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej 4. Wyniki obrazowania przyżyciowego in vivo fagocytozy i zakwaszania biocząsteczek PHrodo Green E. coli przez IC zostały zwalidowane przy użyciu testu cytometrii przepływowej in vitro. Mysikomórka nerkowazawiesina od myszy „IC reporter”, w której IC (CD45 - tdT plus) endogennie eksprymują tdT wystawiono na działanie biocząsteczek pHrodo Green E. coli w porównaniu z komórkami z samą pożywką. Komórki odpornościowe rezydentne CD45 plus w zawiesinie komórkowej bramkowano jako kontrolę pozytywną, a komórki CD45-tdT- (nie-IC) bramkowano jako kontrolę negatywną. Porównanie samych mediów do

Ekspozycja biocząsteczek, zielona fluorescencja wskazująca na pozyskiwanie i zakwaszanie biocząsteczek wzrosła z {{0}},7 do 62,8% komórek CD45 plus. To odkrycie pokazuje oczekiwany wychwyt bakterii przez profesjonalne fagocyty, takie jak neutrofile. Co ciekawe, 22,2 procent IC wychwytywało zielone biocząstki w porównaniu do 5,6 procent nie-IC (ryc. uzupełniająca 2 0), kontrola pożywkowa wychwytywała 0,7 procent IC i 0 procent nie-IC.

Dyskusja

ICs są trudne do zbadania, szczególnie u ludzi, ponieważ stanowią tylko 7 procentnerkakomórki składają się z szeregu podtypów i nie zachowują swojego fenotypu w hodowli 33 . Chen i in. 22 zgłosiło analizę pojedynczych komórek na myszachnerkakomórki i Lake et al. zgłosił jednojądrowy potok sekwencjonowania RNA na człowiekunerkakomórki 34,35 . W badaniach tych zidentyfikowano dwa podtypy A-IC. Tutaj opracowaliśmy metodologię wykonywania sekwencjonowania pojedynczych komórek na żywych wzbogaconych ludzkich układach scalonych. Wzbogaciliśmy się o opłacalne układy scalone, a nie sekwencjonowanie wszystkichnerkakomórki, aby umożliwić większą koncentrację na tym typie komórek. Nasze główne ustalenia to (a) identyfikacja, że ​​hybrydowe PC-IC mogą zmieniać kierunek prędkości RNA z PC na A-IC w odpowiedzi na ekspozycję na UPEC, (b) istnieją co najmniej trzy podtypy A-IC i ich względne częstości mogą zmieniać się w odpowiedzi na ekspozycję na UPEC, (c) dojrzewanie fagosomów jest wiodącym szlakiem biologicznym w wielu podtypach A-IC i może wzrosnąć na znaczeniu względnym wraz z ekspozycją na UPEC, oraz (d) IC fagocytują i zakwaszają UPEC in vivo podczas obrazowania żywych myszy.

IC różnicują się w odpowiedzi na kwasicę poprzez odwrócenie polaryzacji 36,37 . Doniesiono, że IC powstają z komórek wykazujących ekspresję AQP2-38. W 2017 roku Chen i współpracownicy zidentyfikowali komórki podwójnie dodatnie, które wyrażały Aqp2 wraz z Slc4a1 lub Slc26a4 poprzez profilowanie pojedynczych komórek mysich. Odkrycia te zostały potwierdzone przez Park i współpracowników w następnym roku 22,35 . W 2019 roku wykazaliśmy za pomocą immunoznakowania białek i mRNA, że istnieją hybrydowe PC–IC 15 . W szczególności, 9 procent mysich IC określonych przez fluorescencyjne znakowanie immunologiczne V-ATPazą B1 wyrażało również mRNA Aqp2 określony przez fluorescencyjną hybrydyzację in situ15. W niniejszym badaniu zdefiniowano populację ludzinerka-zbieranie komórek kanałowych, które wyrażają AQP2, ATP6V1G3 i SLC4A1 zgodnie z hybrydowymi PC–IC. Na wykresach tSNE i UMAP te komórki hybrydowe skupiały się najbliżej PC, ale różniły się od tradycyjnych PC opartych na ekspresji markera IC. Ekspresja SLC8A1 była odmienna dla tego typu komórek. Co ciekawe, SLC8A1 jest silnie zaangażowany w przejście z nabłonka do mezenchymów. W szczególności brak SLC8A1 transformuje fenotypy komórek nabłonkowych poprzez destabilizację E-kadheryny za pośrednictwem kateniny39. Tutaj pokazujemy, że IC różnicują się w odpowiedzi na ekspozycję na uropatogen. Hybrydowe komórki PC–IC zmieniają prędkość RNA, pochodną czasową ekspresji mRNA, z dala od PC i w kierunku A-IC w odpowiedzi na UPEC. U myszy Ransick i in. 30 zidentyfikował ekspresję Slc8a1 głównie w dystalnym kanaliku krętym i komórkach przypominających PC w kanaliku łączącym. O ocenie naszych obrazów z mikrokopii konfokalnejnerkaEkspresja SLC8A1, znaleźliśmy izolowane komórki, które eksprymowały SLC8A1 w kanalikach AQP2-dodatnich (np. przewodach zbiorczych lub kanalikach łączących). Zidentyfikowaliśmy również AQP2-ujemne kanaliki, w których większość komórek eksprymowała SLC8A1, potencjalnie zgodne z wyżej wspomnianą ekspresją Slc8a1 kanalików dystalnych krętych u myszy. Niektóre podtypy A-IC mają różne wiodące szlaki biologiczne w następstwie ekspozycji na UPEC, a podtyp A-IC wzrasta ze względną częstością w odpowiedzi na UPEC. Odkrycia te wskazują, że podtyp A-IC może reprezentować wrodzony wariant odpornościowy. Rola SLC8A1 w różnicowaniu IC wymaga zbadania w przyszłych badaniach.

CISTANCHE POPRAWI NIEWYDOLNOŚĆ NEREK/NEREK

Przeprowadziliśmy sekwencje scRNA na 1861 człowiekunerkakomórki, z których 1066 było IC. Aby skontekstualizować mysie modele eksperymentalne z patofizjologią człowieka, ważne będzie porównanie ludzkich i mysich układów scalonych. Chen i współpracownicy wzbogacili o mysie układy scalone za pomocą c-KIT i przeprowadzili sekwencje scRNA 22 . Sklasyfikowali 74 komórki jako PC, 87 jako A-IC, a 23 jako B-IC22. Ransick i in. 30 wykonało sekwencje scRNA na 688 IC. Nie wzbogacały o układy scalone, a raczej dzieliłynerkado kory, rdzenia wewnętrznego i rdzenia zewnętrznego w celu oceny różnic strefowych 30 . Wykazaliśmy, że ekspresja markera typu mysich komórek przewodu zbiorczego wydaje się być w dużej mierze zachowana w ludzkich komórkach przewodu zbiorczego. To, czy myszy mają porównywalne podtypy A-IC do ludzi, będzie prawdopodobnie wymagało ukierunkowanej oceny pojedynczej komórki większej liczby mysich IC.

Zidentyfikowaliśmy ekspresję scRNA-seq IC białek wrodzonej odporności, takich jak immunologiczny i zapalny mediator galektyna 3 (LGALS3) oraz ADM, które wcześniej opisywaliśmy w IC gryzoni 15,40-42. Jednak niektóre kluczowe białka wrodzonej odporności wcześniej zgłaszane w IC, takie jak Lipokalina 2 (LCN2/NGAL), RNASE7 i receptor Toll-podobny 4 (TLR4), wykazywały minimalną ekspresję lub nie były obserwowane w ludzkich IC na poziomie pojedynczej komórki w nasza analiza 6,9 . Niedobór ekspresji LCN2/NGAL i TLR4 w IC jest zgodny z tym, co zostało opisane w mysich IC przez naszą grupę badawczą wraz z Ransick et al. 30nerkabadacz komórek/] 15 . Chen i in. 22 zgłosiło pewną ekspresję mRNA TLR4 i NGAL w IC, ale kilka razy mniej niż w PC. Oceniliśmy połączone ludzkie ICs pod kątem ekspresji RNASE7 i zidentyfikowaliśmy je w ICs od 1 z 4nerki(rysunek uzupełniający 18), wskazujący, że jego ekspresja może być przerywana w zależności od regionu, punktu czasowego i warunków fizjologicznych. Wykazano, że ekspresja CISH, która jest indukowana w IC nonA non-B w odpowiedzi na UPEC, reguluje wrodzoną odpowiedź immunologiczną na Mycobacterium tuberculosis w płucach i śledzionie43. ICs fagocytowały bakterie przez kilka minut, a nasze komórki pod kątem sekwencji scRNA zostały wystawione na działanie UPEC przez stosunkowo krótki czas 1 godziny. Potrzebne są dalsze badania, aby ustalić, czy inne szlaki IC, takie jak ekspresja AMP lub regulacja śmierci komórek, staną się bardziej widoczne w późniejszych punktach czasowych po ekspozycji na UPEC.

Phagocytosis involves the cellular uptake of particulates >0,5 μm przez otoczkę błony komórkowej 44 . „Profesjonalne fagocyty”, komórki odpornościowe pochodzenia szpikowego, w tym makrofagi, neutrofile i osteoklasty, odróżniają inwazyjne drobnoustroje od mikrobioty i zdrowych komórek, pochłaniają cel w fagosom, wytwarzają reaktywne formy tlenu (ROS), wydzielają AMP i prezentują antygeny inne komórki 45–49 . Co ważne, silne zakwaszenie fagolizosomów przez V-ATPazę tworzące kwaśne mikrośrodowisko wystarczające do zabicia większości drobnoustrojów jest cechą charakterystyczną profesjonalnych fagocytów48,50. Na przykład, hamowanie V-ATPazy bafilomycyną A1 hamuje aktywność bakteriobójczą makrofagów51. Niektóre komórki nabłonkowe fagocytują drobnoustroje, ale są mniej skuteczne w zabijaniu bakterii niż profesjonalne fagocyty i zostały opisane jako fagocyty nieprofesjonalne52. IC reprezentują linię nabłonkową, która ma zdolność fagocytozy i prezentacji antygenu (ryc. 6–9) wraz z silną ekspresją AMP i hojnymi mitochondriami do generowania ROS; Wydaje się zatem, że ICs mają bardziej porównywalny potencjał zabijania bakterii do makrofagów niż wspomniane wcześniej fagocyty nieprofesjonalne853-55. Uprzednio wykazano, że A-IC są zdolne do wysokich wskaźników endocytozy wierzchołkowej dekstranu w pęcherzykach cytoplazmatycznych56. Spekulujemy, że fagocytoza IC UPEC jest rozszerzeniem cech wspólnych z makrofagami, w tym ekspresji V-ATPazy, potencjału redoks, wydzielania AMP i zdolności endocytozy8,16,49,57,58. Pozostaje do ustalenia, czy IC mogą fagocytować szczątki komórkowe i bakterie inne niż UPEC w podobny sposób jak profesjonalne fagocyty.

Obrazowanie konfokalne pojedynczegonerkaPerfuzja kanalików in vivo z bakteriami rozszerza wcześniejsze techniki in vitro, takie jak hodowla komórkowa i perfuzja wyciętych kanalików. Tutaj opracowaliśmy metodologię bezpośredniego testowania na żywych myszach, czy fagocytoza jest funkcją IC. Mikroskopia przyżyciowa pozwala na skomplikowane badanie dynamicznych procesów komórkowych w obrębie funkcjonowania myszynerki59 . Wcześniejsze strategie wykorzystania mikroskopii przyżyciowej obejmowały ogólnoustrojowe wstrzykiwanie barwników lub markerów przyżyciowych myszom w celu zbadania endocytozy kanalików proksymalnych.nerkadynamika przepływu krwi i przepuszczalność naczyń lub kłębuszków 60 . Gdy mikroskopia przyżyciowa jest połączona z wyrafinowanymi technikami chirurgicznymi, można badać trudne do oceny wczesne punkty czasowe procesów zakaźnych 61 . Wcześniej bakterie poddano mikroperfuzji w proksymalnych kanalikach szczura w celu oceny przepływu krwi, rekrutacji neutrofili i niedrożności dróg moczowych62,63. Zdecydowana większość ZUM jest spowodowana wstępującym patogenem i początkowo napotyka kanał zbiorczy 64,65 . Dlatego proponujemy, że kanał zbiorczy jest kluczowym regionem rurkowym do oceny interakcji gospodarz-patogen. Nasz system modeli przyżyciowych skutecznie odtwarza klasyczny

CISTANCHE POPRAWI CHOROBY NEREK/NEREK

badanie perfuzji pojedynczego kanalika zbiorczego, ale u żywej myszy z nienaruszonymnerka,dopływ krwi, limfy i neuronów wraz z zachowaną zdolnością do interakcji z komórkami odpornościowymi. Patofizjologia odmiedniczkowego zapalenia nerek wyróżnia mężczyzn i kobiety. Na przykład u ludzi, samice są pięć razy bardziej narażone na rozwój ostrego odmiedniczkowego zapalenia nerek, ale samce myszy mają zwiększone nasilenie odmiedniczkowego zapalenia nerek, w którym pośredniczy androgen 66,67. Ransick i współpracownicy wykazali zróżnicowane różnice między kobietami i mężczyznami w komórkach kanalika proksymalnego, szczególnie w organicznych transporterach anionów 30 . Męskie IC oceniano zarówno w naszych badaniach sekwencjonowania pojedynczych komórek, jak i badaniach przyżyciowych. Ze względu na rolę IC w obronie bakteryjnejnerkaRównowaga elektrolitowa, związana z płcią różnorodność funkcji IC, takich jak fagocytoza i ekspresja genów w pojedynczej komórce, będą kluczowymi obszarami przyszłych badań. To badanie ma ograniczenia. Ekspozycja UPEC na ludzkie ICs w naszej sekwencji scRNA była in vitro do pojedynczegonerkai mogą mieć różnice w porównaniu z ekspozycją UPEC in vivo. Ponadto nasze odkrycia reprezentowały obszar anatomiczny człowiekanerkapróbki i przyszłe badania w różnych lokalizacjach mogą charakteryzować się regionalizacją różnorodności, jak wykazali Ransick et al. 30 . ICs stanowiły 57 procent komórek w naszym seq scRNA, wzbogacone o ~7 procent składu IC wnerkina poziomie podstawowym 33 . Nasza próbka zawierała kilka innych typów komórek nabłonkowych i śródbłonkowych, ale była negatywna dla komórek odpornościowych CD45 plus, które zostały posortowane przed wzbogaceniem IC (ryc. 1, ryc. uzupełniająca 1). Dzięki scRNA-seq, docelowe IC mogą być identyfikowane i oceniane oddzielnie. Hematopoetyczne komórki macierzyste wyrażają c-KIT, ale prawdopodobnie nie reprezentująnerkarezydualne populacje komórek szpikowych 68 . Nie zidentyfikowaliśmy innych komórek wykazujących ekspresję c-KIT obecnych u zdrowego człowiekanerki, takich jak komórki zrębowe/telocyty 69 . Niektóre izolowane pętle Henlego i proksymalnego kanalika dodatniego c-KIT były wcześniej zgłaszane nanerkaimmunohistochemia zgodna z naszymi wynikami scRNA-seq 70