Niskie stężenia parakwatu indukują wczesną aktywację regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym kinazy 1/2, kinazy białkowej B i kinazy C-Jun N-końcowej 1/2.

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Mireia Niso-Santano, Jose´ M. Mora´n, Lourdes Garcı´a-Rubio, Ana Go´mez-Martı´n, Rosa A. Gonza´lez-Polo, Germa´n Soler,§ i Jose´ M. Fuentes

Abstrakcyjny:

Parakwat jest herbicydem o potencjalnym ryzyku wywołania parkinsonizmu ze względu na wykazaną neurotoksyczność i silne podobieństwo strukturalne do 1-metylo-4-fenylopirydyny (MPP plus ), dobrze znanej neurotoksyny, która powoduje podobny zespół kliniczny doChoroba Parkinsona(PD). Jednak obecnie niewiele wiadomo na temat szlaków sygnałowych aktywowanych przez parakwat w dowolnym układzie komórkowym. W tym badaniu zbadaliśmy wpływ parakwatu na pozakomórkowe regulowane przez sygnał kinazy 1 i 2 (ERK1/2), c-Jun N-końcową kinazę (JNK) i kinazę białkową B (PKB) w komórkach E18. Niskie stężenia parakwatu stymulowały bardzo wczesny wzrost fosforylacji ERK1/2, JNK1/2 i PKB. Inhibitory kinazy 3-fosfatydyloinozytolu (PI-3K) wortmaninę i LY 294002 (2-(4-morfolinyl)-8-fenyl-4H{{ 19}}benzopiran-4-on) hamował wczesny wzrost fosforylacji PKB indukowany przez parakwat. Ponadto wczesne wzrosty aktywacji ERK1/2 za pośrednictwem parakwatu były wrażliwe na inhibitor kinazy białkowej 1 (MEK1) PD 98059(2#-amino-3#-metoksyflflawon), podczas gdy odpowiedzi JNK1/2 były blokowany przez inhibitor JNK1/2 SP 600125 (antra[1-9-cd]pirazol-6(2H)-on). Wstępne traktowanie wortmaniną, LY 294002 lub PD 98059 nie miało wpływu na śmierć komórek parakwatu w komórkach E18. W przeciwieństwie do tego SP 600125 znacząco zmniejszał śmierć komórkową indukowaną parakwatem w komórkach E18. Podsumowując, wykazaliśmy, że niskie stężenia parakwatu stymulują silny bardzo wczesny wzrost fosforylacji ERK1/2, JNK1/2 i PKB w komórkach E18. Ponadto przedstawione dane sugerują, że hamowanie szlaku JNK1/2 chroni komórki E18 przed śmiercią komórkową indukowaną parakwatem i potwierdzają fakt, że hamowanie wczesnej aktywacji JNK1/2 może stanowić potencjalną strategię w leczeniu PD. Słowa kluczowe: parakwat; niskie stężenia; JNK; śmierć komórki; Parkinsona.

Zioło przeciw chorobie Parkinsona:cistanche

WPROWADZANIE

choroba Parkinsona (PD)jest zaburzeniem neurodegeneracyjnym charakteryzującym się śmiercią neuronów dopaminergicznych w sub-Constantia nigra w połączeniu z inkluzjami wewnątrzcytoplazmatycznymi znanymi jako ciała Lewy'ego (Olanow i Tatton, 1999). Tylko 5–10 procent pacjentów z chorobą Parkinsona ma rodzinną postać tej choroby z autosomalnym dominującym sposobem dziedziczenia (Gasser, 2001). Czynniki genetyczne są ważne u pacjentów z młodym początkiem, ale prawdopodobnie nie będą odgrywać głównej roli w bardziej powszechnej sporadycznej PD. Natomiast badania epidemiologiczne wskazują na kilka czynników środowiskowych, które zwiększają ryzyko rozwoju PD(Choroba Parkinsona). Obejmowały one pestycydy, herbicydy, chemikalia przemysłowe, rolnictwo i życie w środowisku wiejskim (Cory-Slechta i in., 2005; Gasser, 2001; Landrigan i in., 2005; Tanner i BenShlomo, 1999). Najbardziej przekonujący argument na poparcie czynnika środowiskowego w PD dotyczy odkrycia biologicznych skutków MPTP (1-metylo-4-fenyl-1,2,3,6- tetrarchydropirydyna). Ta toksyna ośrodkowego układu nerwowego powoduje zespół, który jest klinicznie i anatomicznie podobny do choroby Parkinsona (Kopin i Markey, 1988; Langston i wsp., 1983). W tym sensie powszechnie stosowany herbicyd parakwat (1,1#-dimetylo-4,4#-bypirydynium) został zasugerowany jako przypuszczalny czynnik ryzyka w oparciu zarówno o jego homologię strukturalną do MPPþ, aktywnego metabolitu MPTP ( Tanner i Langston, 1990) oraz o doniesieniach o parkinsonizmie skorelowanym z ekspozycją na czynnik (Hertzman i in., 1990; Hubble i in., 1993; Jimenez-Jimenezet i., 1992; Liou i in., 1997; Wang i in. al., 1992). Jednakże, chociaż szlaki sygnalizacyjne zaangażowane w śmierć komórek MPPþ są dobrze znane (Halvorsen i wsp., 2002; Gomez-Santos i wsp., 2002; Gonzalez-Polo i wsp., 2003), bardzo niewiele wiadomo na temat aktywowanych szlaków sygnalizacyjnych przez parakwat (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) W każdym razie nie ma badań dotyczących wczesnych zdarzeń obserwowanych po ekspozycji na niskie stężenia parakwatu.

Kilka bodźców, w tym MPPþ i parakwat, może aktywować szereg wewnątrzkomórkowych kaskad sygnalizacyjnych, które są ściśle związane zarówno ze szlakami śmierci komórki, jak i jej przeżycia. Na przykład MPPþ (Gomez-Santos i wsp., 2002; Halvorsen i wsp., 2002) aktywuje członków rodziny kinaz białkowych aktywowanych mitogenami (MAPK) i kinazy białkowej B (PKB). Członkowie rodziny TheMAPK są aktywowani przez MPPþ lub parakwat, w tym kinazy regulowane sygnałem zewnątrzkomórkowym 1 i 2 (ERK1/2), kinazy c-Jun N-końcowe (JNK1 i JNK2) oraz p38 MAPK. Ogólnie przyjmuje się, że ERK1/2 a aktywacja PKB promuje przeżycie komórek poprzez aktywację antyapoptotycznych szlaków sygnałowych, podczas gdy aktywacja JNK1/2 i p38 MAPK jest związana ze śmiercią komórek neuronalnych (Harper i LoGrasso, 2001; Shin i wsp., 2001; Xia i wsp., 1995). . Aktywacja szlaku kinazy 3-fosfatydyloinozytolu (PI-3K)/PKB jest zaangażowana w przeżycie neuronów (Shin i wsp., 2001). W szczególności aktywacja szlaku JNK1/2 może odgrywać kluczową rolę w toksyczności MPPþ i parakwatu (Cassarino i wsp., 2000; Halvorsen i wsp., 2002; Peng i wsp., 2004), a w konsekwencji w procesach komórkowych, na które wpływa PD(Choroba Parkinsona).

Herb cistanche: choroba przeciw Parkinsona

MATERIAŁY I METODY

Linia komórkowa i hodowla.

W badaniu tym zastosowano spontanicznie unieśmiertelnione neuroblasty mózgu szczura, komórki E18. Linia komórkowa E18 została uzyskana przez spontaniczne unieśmiertelnienie z hodowli 18-jednodniowego płodu szczurzego kory mózgowej i została udostępniona dzięki uprzejmości dr A. Mun˜oz (Instituto de InvestigacionesBiome'dicas, CSIC, Madryt, Hiszpania) . Komórki E18 reprezentują prymitywne neuroblasty, które eksprymują NF 68 i prymitywny marker neuronalny nestynę, ale nie mają markera astrocytów, kwaśnego fibrylarnego białka glejowego. Po częściowej indukcji różnicowania za pomocą dibutyryl-cAMP, komórki eksprymują dodatkowe markery neuronalne, takie jak NF 145, NF 220 i enolazę swoistą dla neuronów (Mun˜oz, doniesienie osobiste). Komórki hodowano w F-12 Hanksa (Hyclone, Brevieres, Francja) i uzupełniono 10% FCS (Hyclone), streptomycyną (100 mg/ml) i penicyliną (100 U/ml). Komórki wysiano w 5 3 10 5 w 75-cm2 kolbie do hodowli tkankowej (TPP, Trasadingen, Szwajcaria) i inkubowano w 37°C w atmosferze 5 procent CO2/95 procent powietrza. Hodowle pasażowano raz w tygodniu przez trypsynizację przy użyciu roztworu trypsyny-EDTA (Hyclone).

Zabiegi komórkowe.

Konfluentne komórki (~80%) w 75-cm2 butelkach do hodowli tkankowych trypsynizowano i wysiano na szalkach do hodowli tkankowych w stężeniu 5 3104 komórek/cm2. Dwadzieścia cztery godziny później pożywkę odessano i zastąpiono samą świeżą pożywką lub pożywką zawierającą wskazane stężenia parakwatu. W dalszych eksperymentach różne stężenia inhibitorów kinaz (LY 294002, wortmannina, SP 600125 i PD(Choroba Parkinsona)98059, wszystkie z Tocris, Bristol, Wielka Brytania) dodano 30 min przed ekspozycją na parakwat. Ponieważ inhibitory kinaz rozpuszczono w dimetylosulfotlenku, wykonano kontrole o najwyższym zastosowanym stężeniu (0,2% obj./obj.). Dodatek dimetylosulfotlenku nie wpłynął na wartości żywotności płytek kontrolnych.

Test żywotności komórek.

Żywotność komórek określono w teście kolorymetrycznym MTT (Mosmann, 1983). W żywych komórkach, mitochondrialny enzym dehydrogenaza bursztynianowa może metabolizować MTT do barwnika formazanu, który absorbuje światło przy 57 0 nm. Do tych eksperymentów użyto 24-dołkowych płytek testowych. Pod koniec każdego traktowania, do każdej płytki dodano 100 ul MTT przygotowanego w stężeniu 5 mg/ml w PBS. Po 3 godzinach inkubacji pożywkę zdekantowano, a osady formazanu rozpuszczono w kwaśnym izopropanolu (0,04-0,1 N HCl w absolutnym izopropanolu). Absorbancję przekształconego barwnika mierzono przy długości fali 570 nm z odjęciem tła przy 630–690 nm. Absorbancję nietraktowanych kultur ustawiono na 100 procent .

Aby potwierdzić wyniki uzyskane w teście MTT, oceniano również śmierć komórek, mierząc uwalnianie enzymu cytozolowego dehydrogenazy mleczanowej (LDH) do pożywki hodowlanej przy użyciu zestawu kolorymetrycznego testu LDH (Roche, Indianapolis, IN) zgodnie z instrukcjami producenta . Wyciek LDH zdefiniowano jako stosunek aktywności LDH w pożywce hodowlanej do całkowitej aktywności na studzienkę (3100). Porównywalne dane uzyskano przy użyciu obu metod.

Przygotowanie ekstraktów komórkowych i analiza Western blot.

Po eksperymentalnym traktowaniu komórki (hodowane na 60- szalkach mm) przepłukano dwukrotnie zimnym PBS i usunięto przez zeskrobanie, a następnie odwirowano przy 900 3 g przez 5 min w 4°C. Komórki poddano lizie w buforze zawierający 50mM HEPES, pH 7,5, 300mMNaCl, 1 procent Triton X-100, 2mM EDTA, 5mM MgCl2, 25mM NaF, 1mMNa3VO4 i koktajl inhibitora proteazy (Sigma, St Louis, MO). Komórki wirowano przy 13,000 3 g przez 5 min w 4°C. Supernatanty przechowywano w 80°C do czasu analizy metodą Western blot. Stężenie białka mierzono według Bradforda (1976) stosując jako standard BSA.

Równe ilości białek (10LG na stan) rozdzielono w 12% elektroforezie w żelu SDS i przeniesiono na membrany PVDF zgodnie z konwencjonalnymi, częściowo zmodyfikowanymi metodami (Fuentes i wsp., 2000). W skrócie, białka przeniesiono (250 mA przez 60 min) na membrany PVDF przy użyciu aparatu Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad, Hercules, CA). Procedura immunodetekcji obejmuje przeniesienie i blokowanie membrany (60 min w temperaturze pokojowej) za pomocą TTBS (10mM Tris/HCl, pH 7,5, 150mM NaCl i 0,2% Tween-20) zawierającego 10% odtłuszczonego mleka w proszku. Błony następnie inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej z króliczymi poliklonalnymi przeciwciałami podstawowymi (wszystkie z Cell Signalling, Beverly, MA, rozcieńczone 1:1000) w TTBS 10% odtłuszczonego mleka w proszku lub 5% BSA. Po przemyciu (przez dwa 5-minutowe okresy TTBS), błony inkubowano (60 minut w temperaturze pokojowej) ze sprzężonymi z peroksydazą przeciwkróliczymi przeciwciałami drugorzędowymi (1:5000 w TTBS z 10% odtłuszczonym mlekiem w proszku). Po przemyciu (przez dwa okresy 5-min i jeden okres 10-min), wykrycie związanych przeciwciał było wizualizowane za pomocą chemiluminescencji przy użyciu odczynnika ECL-plus (Amersham Biosciences, Orsay, Francja) i analizowane przez Quantity Jedno oprogramowanie (Bio-Rad). Zawartość aktyny analizowano jako kontrolę stosując królicze przeciwciało poliklonalne (z Sigma) rozcieńczone 1:2500 w TTBS z 10% odtłuszczonym mlekiem w proszku).

Analiza statystyczna.

Każdy eksperyment był powtarzany co najmniej trzykrotnie z zadowalającą korelacją wyników poszczególnych eksperymentów. Przedstawione dane pochodzą z reprezentatywnego eksperymentu; każda grupa składała się średnio z trzech do czterech naczyń hodowlanych. Wszystkie dane wyrażono jako średnią ±SEM. Wyniki analizowano metodą ANOVA. Wartości p mniejsze niż 0.05 uznano za istotne.

Choroba przeciw Parkinsona:Ekstrakt z Cistanche

WYNIKI

Cytotoksyczne działanie parakwatu w komórkach E18

Jak doniesiono wcześniej (Cappelletti i wsp., 1998; Chun i wsp., 2001; Gonzalez-Polo i wsp., 2004), kilka linii komórkowych jest wrażliwych na toksyczne właściwości parakwatu. Ekspozycja na parakwat spowodowała zależne od dawki zmniejszenie żywotności komórek. (Fig. 1.) W tym badaniu komórki E18 traktowane 25 µM parakwatem przez 24 godziny wykazywały 50 procentową utratę żywotności komórek. Żywotność komórek oceniano mierząc transformację do MTT w barwnik formazan, który absorbuje światło przy 570 nm. Test ten jest szeroko stosowany do monitorowania śmierci komórek w kilku liniach komórkowych, w tym w komórkach E18 (Donaire i wsp., 2005; Garcia-Roman i wsp., 2001) oraz różnych urazach, w tym parakwacie (Chun i wsp., 2001; Gonzalez -Polo i in., 2004).

Aktywacja ERK1/2 indukowana parakwatem w komórkach E18

Wzrost aktywacji ERK1/2 w komórkach E18 traktowanych parakwatem monitorowano metodą Western blot przy użyciu fosfospecyficznego przeciwciała ERK1/2 (Thr202/Tyr204). Ekspozycja komórek E18neuroblastów na 25 µM parakwatu spowodowała wyraźny wzrost stanu fosforylacji (Thr202/Tyr204) ERK1/2 (44/42 kDa) (Fig. 2A). Maksymalny wzrost fosforylacji wystąpił po 5 min, po czym poziomy fosforylacji powoli spadają do poziomów zbliżonych do podstawowych. Ponadto wzrosty fosforylacji ERK1/2 indukowane przez parakwat nie były zależne od stężenia (Fig. 2B). Obróbka wstępna inhibitorem theMEK1, PD(Choroba Parkinsona)98059 (50 µM; Dudley et al., 1995) całkowicie hamował indukowany parakwatem wzrost fosforylacji ERK1/2 (Fig. 3).

Aktywacja PKB indukowana parakwatem w komórkach E18

Aktywację PKB w komórkach E18 wykryto metodą Western blot przy użyciu przeciwciała fosfospecyficznego (Ser473). Stymulacja komórek E18 25 µM parakwatem spowodowała wyraźny wzrost fosforylacji PKB (Fig. 4A). Ten wzrost występuje po 20 minutach, porównywalny z fosforylacją ERK1/2, po tym, jak poziomy fosforylacji powoli spadały do ​​poziomów zbliżonych do podstawowych (ryc. 4A). Ponadto wzrost fosforylacji PKB, w którym pośredniczy parakwat, był zależny od stężenia, z maksimum przy 25 µM parakwatu (ryc. 4A). Ponieważ PI-3K jest wymagany do aktywacji PKB, zbadano rolę PI-3K w indukowanej parakwatem aktywacji PKB w komórkach E18 przy użyciu inhibitorów PI-3K, wortmaniny i LY 294002.

Wzrost fosforylacji PKB, w którym pośredniczy parakwat, został całkowicie zablokowany po wstępnym potraktowaniu (30 minut) komórek E18 100 nM wortmaniną i 30 ?M LY 294002 (Fig. 5). Obserwacje te pokazują, że szlak zależny od PI-3K pośredniczy w indukowanym przez parakwacie wzroście fosforylacji PKB w komórkach E18.

Aktywacja JNK1/2 indukowana parakwatem w komórkach E18

Wcześniejsze badania wykazały, że parakwat aktywuje neurony JNK1/2in (Chun i wsp., 2001; Peng i wsp., 2004) oraz komórki nieneuronalne (Bennett i wsp., 2001; Cheng i wsp., 2003). Stosowane stężenia są jednak znacznie wyższe niż stosowane w tej pracy. Dodatkowo czasy wybrane do wizualizacji aktywacji JNK1/2 są również dłuższe. Aktywację JNK1/2 w komórkach E18 wykrywano metodą Western blot przy użyciu fosfospecyficznego przeciwciała JNK (Thr183/Tyr185). Stymulacja komórek E18 25 µM parakwatem spowodowała wyraźny i wczesny wzrost fosforylacji JNK (46/54 kDa) (Fig. 6A). Wzrosty te były maksymalne po 5 minutach, po których poziomy fosforylacji obniżyły się w kierunku poziomów podstawowych (ryc. 6A). Jednak wzrost fosforylacji JNK1/2 za pośrednictwem parakwatu nie był zależny od stężenia (ryc. 6B). Wzrost fosforylacji JNK1/2 za pośrednictwem parakwatu był wrażliwy na inhibitor JNK1/2 SP 600125 (10 µM; Fig. 7; Bennett i wsp., 2001). Wreszcie, parakwat (25 µM) nie stymulował mierzalnych wzrostów fosforylacji p38 MAPK w komórkach E18 w tych samych doświadczeniach z przebiegiem czasowym (dane nie pokazane). Doświadczenia te przeprowadzono przy użyciu fosfospecyficznego przeciwciała p38 MAPK(Thr180/Tyr182).

Pomiar żywotności komórek po traktowaniu komórek E18 parakwatem i inhibitorami kinazy

Po wykazaniu, że parakwat we wszystkich przypadkach wywołuje wczesną aktywację ERK1/2, PKB i JNK1/2 w komórkach E18, określiliśmy następnie rolę szybkiej aktywacji tych szlaków kinaz w śmierci komórkowej indukowanej niskimi stężeniami parakwatu przy użyciu swoistych farmakologicznie inhibitory. Jak pokazano na Figurze 1, ekspozycja komórek E18 na 25 µM parakwatu indukowała znaczące zmniejszenie żywotności komórek (około 50%). Aby zbadać rolę ERK1/2, PKB i JNK1/2 w indukowanej parakwatem śmierci komórkowej, komórki E18 inkubowano przez 30 min z następującymi inhibitorami kinaz: PD(Choroba Parkinsona)98059 (50 µM; inhibitor MEK1/2), LY 294002 (30 µM; inhibitor PI-3K), wortmanina (100 nM; inhibitor PI{-3K) i SP 600125 (10 µM; inhibitor JNK1/2). Jak pokazano na Figurze 8 (i podsumowano w Tabeli 1), wortmannina, LY 294002 i PD 98059 nie miały znaczącego wpływu na utratę żywotności komórek indukowaną przez 25 µM parakwat.

DYSKUSJA

Ostatnio w różnych badaniach wzrosło zainteresowanie możliwością, że neurotoksyny środowiskowe, takie jak pestycydy, mogą być powiązane z rozwojem niegenetycznego PD(Choroba Parkinsona)(Cory Slechta i in., 2005; Landrigan i in., 2005; Norris i in., 2004; Ritz i Yu, 2000; Sherer i in., 2001). PQ jest jednym z możliwych herbicydów, które są zaangażowane w PD, ze względu na podobną strukturę chemiczną z MPPþ i silną korelację między występowaniem choroby a ilością stosowanego PQ (Lanska, 1997; Liou i wsp., 1997; Ritz i Yu, 2000). Jednak mechanizm toksyczności neuronalnej występującej w przypadku niedostatecznej ekspozycji na niskie poziomy parakwatu nie został określony. W każdym razie, poprzednie prace nie są zainteresowane wczesnym procesem widocznym po ekspozycji na parakwat. Głównym odkryciem niniejszego badania jest to, że wykazaliśmy, że komórki E18neuroblastów wystawione na niskie stężenia parakwatrapidu zwiększyły aktywowaną fosforylację ogólnie antyapoptotycznych szlaków sygnałowych PI-3K/PKB i MEK ERK, a także ogólnie proapoptotycznego JNK1/ 2 MAPA. W przeciwieństwie do tego parakwat nie stymulował zależnego od czasu lub stężenia mierzalnego wzrostu fosforylacji p38 MAPK. Jak wskazano powyżej, zastosowaliśmy parakwat o niskim stężeniu. Dyskutowano o znaczeniu faktu, czy parakwat może dostać się do mózgu, czy nie, ponieważ jest naładowaną cząsteczką. Jednak ostatnie odkrycia (Shimizu i wsp., 2001) ujawniły, że parakwat może wykorzystywać pompę neutralnych aminokwasów, aby dostać się do mózgu. Odkrycia przedstawione w tej pracy wskazują, że tylko niskie stężenie parakwatu jest potrzebne w komórce do szybkiej stymulacji kilku szlaków sygnałowych, w tym NK, zaangażowanych w procesy śmierci komórki. Te wczesne aktywacje spowodowane niskim stężeniem parakwatu zostały po raz pierwszy zaproponowane w niniejszej pracy.

Niewiele uwagi poświęcono badaniu zmian poziomów fosforylacji PKB lub ERK1/2 indukowanych przez parakwat (Cheng i in., 2003; Peng i in., 2004). W każdym razie w poprzednich doniesieniach (Peng i in., 2004) stosowano stosunkowo wysokie stężenia parakwatu (400 μM), mierząc stopień fosforylacji ERK po 12–18 godzinach ekspozycji. W tym czasie nie zaobserwowali zmian w poziomach p-ERK. W naszej pracy wykryliśmy wczesną (5-10 min) i ważną aktywację ERK1/2 (ryc. 2A). Ta aktywacja spada powoli do poziomów podstawowych. W naszych warunkach poziomy ufosforylowanego ERK1/2 (po 12-18 godz.) są takie same jak w kontroli, co wskazuje, że ten szlak nie jest aktywny w tych czasach (dane nieprzedstawione), jak opisali Peng i in. (2004). Ta aktywacja nie jest zależna od stężenia, co wskazuje na wynik, że silną stymulację ERK uzyskuje się i utrzymuje przy bardzo niskich stężeniach parakwatu. Zmiany poziomów fosforylowanego PKB nadal nie zostały opisane po ekspozycji na parakwat. Na Figurze 4 pokazujemy, że wyniki są zależne od czasu i stężenia, pokazując maksymalny efekt po 20-min ekspozycji z 25 µM parakwatem. Oznacza to, że wczesne wzrosty fosforylacji PKB, w których pośredniczy parakwat, są porównywalne z tymi obserwowanymi dla ERK1/2. Dane te ujawniają wczesny wzrost aktywacji fosforylacji szlaków przeżycia zarówno PKB, jak i ERK. Nie ma danych dotyczących wczesnej aktywacji PKB lub ERK w przypadku śmierci komórkowej indukowanej parakwatem. Jednak wcześniejsze badania (Halvorsen i wsp., 2002) opisują podobny wczesny wzrost obu ścieżek w komórkach nerwiaka niedojrzałego SH-SY5Y eksponowanych na MPPþ. W tym przypadku poziomy fosforylacji nie spadają w kierunku poziomu podstawowego. Dane te są szczególnie interesujące ze względu na wcześniej powiązaną podobną strukturę parakwatu i MPPþ, co wskazuje na inny początek maszynerii komórkowej związanej z działaniem obu cząsteczek.

Więcej uwagi poświęcono roli szlaku JNK1/2 w przekazywaniu sygnałów przyczyniających się do śmierci komórkowej indukowanej parakwatem. W tym badaniu wykazaliśmy, że niskie stężenia (25 μM) parakwatu wywołały znaczny wzrost ufosforylowanego JNK1/2 (ryc. 6). Jak to ma miejsce w PKBor ERK1/2, aktywacja ta jest zależna od czasu, z bardzo wczesnym początkiem (5 min) i powolnym powrotem do poziomów podstawowych. Wcześniejsze prace (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) pokazują późne (12-18 h) aktywacje szlaku JNK1/2 wytwarzane w każdym przypadku przez stosunkowo wysokie stężenia parakwatu (od 400 µM [Peng i wsp., 2004] do 800 mM [Chunet i wsp., 2001]). W naszych warunkach stopień fosforylacji JNK1/2 we wskazanych czasach jest porównywalny z kontrolą. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wskazują po raz pierwszy, że ekspozycja komórek na bardzo niskie stężenie parakwatu powoduje wczesną aktywację szlaków PKB, ERK1/2 i JNK1/2.

Ustaliwszy, że parakwat wyzwala wczesną aktywację PKB, ERK1/2 i JNK1/2 w komórkach E18, zbadaliśmy następnie rolę tych szlaków kinaz białkowych w indukowanej przez parakwacie śmierci komórkowej przy użyciu kilku inhibitorów farmakologicznych. Żywotność komórek monitorowano mierząc transformację do MTT w barwnik formazan, który absorbuje światło przy 570 nm. Test MTT został wykorzystany do dokładnego pomiaru uszkodzenia neuronów po różnych urazach, w tym MPPþ lub parakwacie (Gonzalez Polo i wsp., 2003, 2004; Schmuck i wsp., 2002; Sheng i wsp., 2002; Storch i wsp., 2004 ) i jest to najczęściej stosowana metoda określania śmierci komórek. Jak pokazano na Figurze 8, wstępne traktowanie selektywnym inhibitorem JNK1/2 SP 600125 znacząco zmniejszyło śmierć komórek wywołaną parakwatem. To stężenie SP 600125 całkowicie zablokowało aktywację JNK1/2 indukowaną parakwatem (Fig. 7). Dane te sugerują, że hamowanie wczesnej aktywacji szlaku JNK1/2 chroni komórki przed śmiercią komórkową indukowaną parakwatem. Dane te są zgodne z wcześniejszymi badaniami (Chun i wsp., 2001; Peng i wsp., 2004), które wykazały, że JNK1/2 bierze udział w śmierci komórek neuronalnych wywołanej parakwatem. Jednak badania te wykorzystują od 15 do 30 razy większe stężenie parakwatu niż w tym badaniu. Pokazujemy również, że niskie stężenia parakwatu mogą powodować nie tylko aktywację, ale także wczesną aktywację tego szlaku. Ochrona obserwowana przy SP600125 wskazuje również, że szlak JNK1/2 bierze udział w śmierci komórkowej indukowanej przez parakwat. Dodatkowo, hamowanie JNK1/2 zostało zaprojektowane jako potencjalna strategia leczenia PD(Choroba Parkinsona)w kilku modelach zarówno in vivo, jak i in vitro (Wang i wsp., 2004).

neuroprotekcyjne działanie cistanche

Wcześniejsze badania wykazały, że zarówno szlaki PKB, jak i ERK są zaangażowane w przeżycie neuronów (Guyton i wsp., 1996; Shin i wsp., 2001). W tym badaniu wykazaliśmy, że niskie stężenia parakwatu wytwarzają i wcześnie stymulują zarówno szlaki PKB, jak i ERK. Obserwacje te sugerują, że indukowana parakwatem aktywacja PKB i ERK może być zaangażowana w ochronę komórek przed śmiercią komórkową wywołaną parakwatem. Aby zbadać tę możliwość, wykorzystaliśmy strukturalnie niepowiązane inhibitory PI-3K wortmaninę i LY 294002 oraz ERK1/2inhibitor PD(Choroba Parkinsona)98059. Co ciekawe, hamowanie zarówno PKB, jak i ERK nie zmieniło żywotności komórek w obecności parakwatu, co sugeruje, że w naszych warunkach zwiększona aktywność PKB i ERK nie ma zasadniczego znaczenia dla przeżycia w przypadku śmierci komórkowej indukowanej parakwatem w komórkach E18.

Powszechnie wiadomo, że w mechanizmie neurotoksyczności parakwatu pośredniczy między innymi stres oksydacyjny (Gonzalez-Polo i wsp., 2004; Mollace i wsp., 2003). W tym sensie opisano ostatnio bardzo szybki cytozolowy stres oksydacyjny we wczesnych zdarzeniach apoptotycznych związanych ze śmiercią komórkową indukowaną parakwatem (Gonzalez-Polo et al., 2004). Ponieważ stres oksydacyjny aktywuje członków rodziny MAPK (takich jak ERK1/2 i JNK1/2) oraz PKB (Kamata i Hirata, 1999), tę wczesną aktywację ERK1/2, JNK1/2 i PKB można przypisać szybkiemu utlenianiu. wywołany stresem po ekspozycji na parakwat.

Podsumowując, nasze wyniki po raz pierwszy pokazują, że niskie stężenia parakwatu stymulują bardzo wczesny i silny wzrost fosforylacji PKB, ERK1/2 i JNK1/2 w komórkach E18. Ponadto wykazaliśmy, że hamowanie wczesnej aktywacji szlaku JNK1/2 chroni komórki E18 przed śmiercią komórkową indukowaną parakwatem. Wynik ten wskazuje na istnienie pewnych wczesnych zdarzeń (takich jak szybka aktywacja JNK1/2), które odgrywają zasadniczą rolę w śmierci komórkowej indukowanej przez niskie stężenia parakwatu. Wynik ten otwiera również nową i ekscytującą linię w badaniach toksyczności parakwatu i jego możliwego wpływu na rozwój PD(Choroba Parkinsona).

NOTATKA: Cistancheto tradycyjne chińskie zioło, które ma wpływ na neurony i komórki mózgowe. cistanche jest również znany jako żeń-szeń pustynny, jest potencjalnym lekiem na choroby neuro, takie jakChoroba Parkinsonaw oparciu o nowoczesne badania farmakologiczne