Część Ⅰ: Rurkowaty mitochondrialny AKT1 jest aktywowany podczas niedokrwiennego urazu reperfuzyjnego i odgrywa kluczową rolę w predyspozycjach do przewlekłej choroby nerek.
Apr 03, 2023
Abstrakcyjny
Dysfunkcja kanalików nerkowych może prowadzić do ostrego uszkodzenia nerek i przekształcenia się w przewlekłą chorobę nerek. Chociaż mitochondria rurkowe są związane z patofizjologią niewydolności nerek, mechanizm jest niejasny. Tutaj pokazujemy, że uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne indukuje ostrą translokację i aktywację mitochondrialnej kinazy białkowej B (znanej również jako AKT1) w kanalikach nerkowych. Postawiliśmy hipotezę, że mitochondrialna sygnalizacja AKT1 może zapobiegać rozwojowi ostrego uszkodzenia nerek i późniejszej przewlekłej choroby nerek. Aby przetestować tę prognozę, wykorzystaliśmy strategię Cre-Lox do wygenerowania dwóch nowych transgenicznych szczepów myszy specyficznych dla kanalików nerkowych, które indukowały ekspresję dominującej negatywnej AKT1 ukierunkowanej na mitochondria lub konstytutywnie aktywnej AKT1. u myszy ukierunkowanych na mitochondria z dominującą AKT{10}}ujemnie hamowanie mitochondrialnej AKT1 zaostrzającej azotemię, uszkodzenie cewek nerkowych, zwłóknienie nerek, stwardnienie kłębuszków nerkowych i przeżywalność po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym. W przeciwieństwie do tego, u ukierunkowanych na mitochondria konstytutywnie aktywnych myszy AKT1, wzmocniona kanalikowa mitochondrialna sygnalizacja AKT1 osłabiła uszkodzenie nerek, chroniła czynność nerek i znacznie poprawiła przeżywalność po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym (odpowiednio 76,9 procent vs. 20,8 procent). Kiedy mitochondrialny AKT1 został zahamowany, stwierdzono wzrost niezwiązanego oddychania mitochondrialnego i stresu oksydacyjnego w kanalikach nerkowych, co potwierdza rolę dysfunkcji mitochondriów w patofizjologii niewydolności nerek. Zatem nasze badanie sugeruje, że rurkowaty mitochondrialny szlak sygnałowy AKT1 może być nowym celem dla rozwoju nowych strategii lepszego zapobiegania i leczenia uszkodzenia nerek.
Oświadczenie translacyjne
Ostre uszkodzenie nerek (AKI) i późniejszy rozwój przewlekłej choroby nerek (CKD) to główne problemy zdrowotne. Opracowaliśmy transgeniczny model myszy i określiliśmy rolę aktywacji AKT mitochondriów proksymalnych kanalików nerkowych w AKI i CKD. Ten ratunkowy mechanizm ochrony nerek może być nowym celem dla opracowania nowych strategii, aby lepiej zapobiegać i leczyć AKI i CKD. Przyszłe badania powinny potwierdzić udział mitochondrialnego szlaku sygnałowego AKT w uszkodzeniu nerek u ludzi i zbadać cele leków w mitochondrialnym szlaku AKT1.
Słowa kluczowe
mitochondrialny Akt1; niedokrwienny uraz refuzyjny; Ostre uszkodzenie nerek; Przewlekłą chorobę nerek;Ekstrakt Cistanche.
Kliknij tutaj, aby uzyskaćCistanche korzyści dla nerek
Wstęp
Ostre uszkodzenie nerek (AKI) i późniejszy rozwój przewlekłej choroby nerek (CKD) to główne problemy zdrowotne. Obecnie specyficzne metody leczenia tych stanów chorobowych są ograniczone, częściowo z powodu braku zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw uszkodzenia nerek. Nerka jest jednym z najbardziej energochłonnych narządów w organizmie, a mitochondria, które są niezbędne do ułatwienia aktywnego transportu, utrzymania odpowiednich gradientów elektrochemicznych i regulacji homeostazy płynów, są głównym źródłem komórkowej produkcji ATP poprzez fosforylację oksydacyjną. zaburzenia produkcji ATP i dysfunkcja mitochondriów mogą prowadzić do zwiększonej produkcji reaktywnych form tlenu (ROS), co z kolei upośledza funkcję komórek nerek i indukuje śmierć komórek. Chociaż zgłaszano uszkodzenia i dysfunkcje mitochondriów u pacjentów z chorobami nerek i modelami zwierzęcymi ostrego i przewlekłego uszkodzenia nerek, wiedza na temat patofizjologicznej roli mitochondriów w uszkodzeniu nerek pozostaje niepełna.
Wzmocniona funkcja mitochondriów może zapobiegać uszkodzeniom niedokrwienno-reperfuzyjnym (IRI). Podczas niedokrwiennej fazy IRI niedobór tlenu hamuje transfer elektronów w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym i zmniejsza produkcję ATP. Późniejszy napływ jonów sodu i wypływ protonów pomaga przywrócić normalne pH i może sprzyjać przeżywalności komórek poprzez przywrócenie objętości wewnątrzkomórkowej. mitochondrialne transbłonowe gradienty elektrochemiczne i aktywacja szlaków apoptotycznych Te zmiany wewnątrzkomórkowe mogą być szkodliwe dla komórek, które przeżyją po początkowym uszkodzeniu niedokrwiennym.
AKI występuje częściej u pacjentów hospitalizowanych i może przyspieszyć wystąpienie nowej CKD, zaostrzyć istniejącą CKD i prowadzić do śmierci nerek. Mechanizmy leżące u podstaw przejścia z AKI do CKD są niejasne. Niedawne badania na zwierzętach sugerują, że dysfunkcja kanalików nerkowych odgrywa ważną rolę w progresji AKI do CKD, odzwierciedlając przejście od AKI do CKD u ludzi. Zrozumienie szlaków sygnałowych, które regulują uszkodzenie nerek, pozwoli nam zidentyfikować nowe cele terapeutyczne w celu złagodzenia uszkodzenia nerek i zapobiegania progresji AKI do CKD.
Związek między cytoplazmatycznymi szlakami sygnałowymi a funkcją mitochondriów podczas uszkodzenia nerek jest w dużej mierze nieznany. Funkcja mitochondriów jest ściśle powiązana z sygnalizacją cytoplazmatyczną, innymi organellami i szlakami jądrowymi Nasze laboratorium zidentyfikowało aktywację i translokację AKT1 do mitochondriów jako kluczowy krok w ochronie kardiomiocytów przed uszkodzeniem IRI poprzez regulację kompleksów fosforylacji oksydacyjnej, zwiększenie wydajności fosforylacji oksydacyjnej i redukcja ROS. Nie wiadomo jednak, czy IRI może wywołać translokację aktywowanej AKT1 z cytoplazmy do mitochondriów w kanalikach nerkowych. Jeśli mitochondrialna AKT1 może być aktywowana w kanalikach nerkowych w odpowiedzi na uszkodzenie nerek, ważna byłaby ocena patofizjologicznej roli mitochondrialnej AKT1 w rozwoju ostrego uszkodzenia nerek (AKI) i przewlekłej choroby nerek (CKD). Tutaj wykorzystaliśmy dwa indukowalne transgeniczne modele myszy specyficzne dla kanalików nerkowych, które modulują mitochondrialną sygnalizację AKT1 in vivo i wykazaliśmy ochronną rolę mitochondrialnej aktywacji AKT1 w kanalikach nerkowych podczas IRI przeciwko AKI i późniejszemu rozwojowi CKD.
Suplementy Cistanche
Wyniki
Aktywacja mitochondrialnego AKT1 w kanalikach nerkowych po IRI
Najpierw zbadaliśmy, czy IRI aktywuje AKT1 w mitochondriach nerek. W tym celu stworzyliśmy model IRI nerki, podwiązując lewą tętnicę nerkową przez 30 minut, a następnie nefrektomię przeciwstronną (Nx). Podwiązanie lewej tętnicy nerkowej odwrócono, aby zakończyć fazę niedokrwienia, wykonano reperfuzję i we wskazanym przedziale czasu pobrano lewą nerkę.
Wyizolowano korę nerkową wzbogaconą w kanaliki nerkowe i przygotowano mitochondria przez subfrakcjonowanie. Po reperfuzji obfitość mitochondrialnych pAKT1 i AKT1 wzrosła, co sugeruje translokację aktywowanego AKT1 do mitochondriów (ryc. 1A). Jest to podobne do tego, co zaobserwowaliśmy w mięśniu sercowym w porównaniu z kontrolami pozornie operowanymi lub kontrolami z resekcją nerki, gdzie mitochondrialna AKT1 była znacząco podwyższona 30-60 minut po reperfuzji (ryc. 1A i B) (n{8}}). Zwiększył się również mitochondrialny pAKT1. Wyniki te sugerują, że indukowana przez IRI aktywacja i translokacja AKT1 do mitochondriów nerkowych. Barwienie iHC potwierdziło fosforylację AKT1 w kanalikach nerkowych po IRI (ryc. 1C). Barwienie tła dla pAKT1 było minimalne w kanalikach nerkowych kontrolnych pozornie operowanych, podczas gdy pAKT1 był dramatycznie podwyższony w kanalikach nerkowych po IRI (ryc. 1C i 1D). Nie zaobserwowano pAKT1 w żadnym obszarze nerek z wyjątkiem kanalików. aby potwierdzić subkomórkową lokalizację pAKT1 w kanalikach, pAKT1 barwiono w połączeniu z markerami mitochondrialnymi. znaczącą kolokację pAKT1 i mitochondriów zaobserwowano w komórkach kanalików nerkowych przy IRI (ryc. 1E). Łącznie wyniki te sugerują translokację IRI i aktywację AKT1 do mitochondriów.
Rycina 1. Ostra translokacja i aktywacja AKT1 w mitochondriach nerkowych wywołana reperfuzją niedokrwienną.
Generowanie transgenicznych myszy z indukowalną specyficzną dla kanalików nerkowych ekspresją dominującej ujemnej AKT w mitochondriach
Aby przetestować hipotezę, że aktywacja mitochondrialnego AKT1 w kanalikach nerkowych podczas IRI chroni nerki przed AKI i późniejszym rozwojem CKD, wygenerowaliśmy transgeniczny model myszy, który umożliwia indukowaną tamoksyfenem (TAM) ekspresję ukierunkowanego na mitochondria specyficznego dla kanalików dominującego negatywnego AKT1. Dominujące negatywne AKT1 (mdnAKT) i mitochondrialne sekwencje kierujące dodano do N-końca. Warunkowa ekspresja tamoksyfenu transgenów AKT1 odbywała się za pomocą pCALNL (patrz Materiały i metody). Aby wykluczyć zakłócające efekty związane z losową integracją macierzy transgenu w genomie, pojedynczą kopię transgenu wprowadzono przez rekombinację homologiczną do komórek ES z ukierunkowanymi transgenami w locus Gt(ROSA) 26 lub na chromosomie. Myszy dwugenowe (KMDAKT) uzyskano przez krzyżowanie indukowanych tam myszy mdnAKT z hemizygotycznymi myszami KSP-CreERT2, gdzie indukowana tam aktywność Cre była napędzana przez specyficzne dla komórek kanalików nerkowych promotory kalmoduliny 16. aktywność Cre indukowana wstrzyknięciem tam, izolowane mitochondria i białka mitochondrialne rozdzielone SDS-PAGE do immunoblottingu. Wyniki pokazały, że TAM z powodzeniem indukował ekspresję zmutowanego AKT1. Zmutowane białko było niewykrywalne u myszy KMDAKT, myszy KSPCreERT2 i myszy typu dzikiego (wstrzyknięcie oleju kukurydzianego).
Aby zweryfikować ekspresję specyficzną dla nerek, białka mitochondrialne ekstrahowano z różnych tkanek po wstrzyknięciu TAM. mutant AKT1 ze znacznikiem his był wyrażany tylko w nerkach. Skrawki nerki barwiono przeciwciałami anty-his-tag i mitochondrialnym Mitotrackerem do obrazowania immunofluorescencyjnego. Wyniki pokazały, że wszystkie mutanty AKT1 były barwione przeciwciałem His-tag i zlokalizowane w mitochondriach. W kłębuszkach nie wykryto mutacji AKT1. Aktywność enzymatyczną mitochondrialnego AKT1 analizowano przy użyciu rekombinowanego GSK3, aby potwierdzić główną negatywną rolę w mitochondriach kanalików KMDAKT poddanych obróbce tam. Ponieważ kanaliki nerkowe mitochondrialne AKT1 są aktywowane przez IRI, porównaliśmy aktywność enzymatyczną AKT1 w mitochondriach wyizolowanych od myszy traktowanych tam i myszy traktowanych olejem kukurydzianym po IRI. Wyniki pokazały, że aktywność mitochondrialnego AKT1 w nerkach była znacząco zahamowana u myszy KMDAKT traktowanych TAM. Dlatego ta transgeniczna linia myszy jest dobrym modelem do badania roli AKT1 w mitochondriach rurkowych.
Korzyści Cistanche
Hamowanie kanalików nerkowych mitochondrialnego AKT pogarszało IRI in vivo
IRI indukowano w przypadku jednostronnego niedokrwienia nerek. W ostatniej serii eksperymentów fosforylowana AKT1 była ledwo wykrywalna w mitochondriach proksymalnych kanalików nerkowych. Nie zaobserwowano znaczących różnic w histologii nerek, azotu mocznikowego we krwi (BUN) i kreatyniny w surowicy (Cr) u myszy KMDAKT, którym wstrzyknięto olej kukurydziany i którym wstrzyknięto tam, co sugeruje, że mitochondrialna sygnalizacja AKT1 nie odgrywa znaczącej roli w strukturze i funkcji nerek na początku badania przed indukcją IRI. Aby zbadać, czy mitochondrialny AKT1 odgrywa rolę ochronną podczas IRI, zastosowano jednostronny IRI do indukcji AKI u myszy z olejem kukurydzianym lub myszy TAM-KMDAKT. nie było różnic w poziomach BUN lub Cr uzyskanych bezpośrednio po indukcji IRI, ale u myszy TAM-KMDAKT zarówno poziomy BUN, jak i Cr były znacząco podwyższone po 45 dniach. Wyniki te sugerują, że zablokowana aktywacja mitochondrialnego AKT1 w kanalikach nerkowych podczas IRI zaostrzyła późny rozwój dysfunkcji nerek. analiza histologiczna skrawków nerek barwionych H&E wykazała, że uszkodzenie nerek nasiliło się u myszy TAM-KMDAKT. Ocena uszkodzenia kanalików nerkowych wg Jablonskiego była wyższa w przypadku utraty rąbka szczoteczkowego kanalików, lizy kanalików i większej ilości zanieczyszczeń w świetle kanalików (p=0.0}18). Aby wykluczyć wpływ rekombinazy TAM lub Cre, przeanalizowaliśmy również myszy KSP / CreERT2, którym wstrzyknięto TAM, a wyniki Jablonskiego były podobne w oleju kukurydzianym myszy KMdakt i TAM-KSP / CreERT2 w dniu 7 po IRI (ryc. 3D) (p {{ 19}}.7613). Dane te sugerują, że nasze odkrycia nie zostały zakłócone przez efekty rekombinazy TAM lub Cre. U myszy TAM-KMDAKT po IRI, barwienie trichromem Massona wykazało większy obszar zwłóknienia (procent) (p <0,001), któremu towarzyszyły nieuporządkowane struktury kanalikowe z odlewami i szczątkami wewnątrz światła. ekspresja col1a była zwiększona, zgodnie z barwieniem trichromem Massona. Ekspresja tGF nie wzrosła, co sugeruje, że mitochondrialny AKT1 nie reguluje odpowiedzi zapalnej. Po IRI ekspresja markera uszkodzenia kanalików - KIM -1 była zwiększona w grupie TAM-KMDAKT, potwierdzając zwiększone uszkodzenie nerek w grupie TAM-KMDAKT (p{31}},002).
Do oceny apoptozy komórek nerkowych zastosowano barwienie TUNEL. Liczba komórek apoptotycznych była istotnie zwiększona w kanalikach (p{0}}.0}054) i kłębuszkach (p<0,001) myszy TAM-KMDAKT w porównaniu z grupą kontrolną. Sugeruje się, że hamowanie kanalikowej mitochondrialnej AKT1 podczas IRI nasila śmierć komórek kanalikowych i uszkodzenie kłębuszków nerkowych. Zgodnie z tym, aktywacja zarówno kaspazy 9 (promotor), jak i kaspazy 3 (wykonawca) była znacząco zwiększona w komórkach nabłonka kanalików nerkowych TAM-KMDAKT. Aby dokładniej zbadać przewlekłe zmiany kłębuszkowe, przeprowadzono analizę barwienia kwasem nadjodowym-Schiffa (PAS) na skrawkach nerek w celu ilościowego określenia stwardnienia kłębuszków nerkowych. Chociaż nie zaobserwowano żadnej różnicy w stwardnieniu kłębuszków nerkowych 7 dni po IRI (p=0,2634), więcej stwardnienia kłębuszków nerkowych stwierdzono u myszy TAM-KMDAKT 45 dni po IRI (p<0,001). To odkrycie sugeruje, że mitochondrialny szlak sygnałowy AKT w kanalikach nerkowych może regulować tworzenie się blizn kłębuszkowych podczas rozwoju CKD. Analiza przeżycia Kaplana-Meiera wykazała wpływ hamowania kanalikowej mitochondrialnej AKT na wynik IRI. Przeżywalność była zmniejszona po IRI u myszy TAM-KMDAKT w porównaniu z kontrolami (p=0,0013).
Wskaźnik przeżywalności myszy TAM-KMDAKT był znacznie niższy niż w grupie kontrolnej w ciągu 7 dni po IRI, ale poziomy BUN/Cr myszy TAM- i oleju kukurydzianego-KMDAKT były podobne w tym okresie. Zgłoszone zmiany BUN / Cr u myszy leczonych TAM mogły być niedoszacowane z powodu niedostępności danych BUN / Cr od martwych myszy. Ponadto wyższa śmiertelność u myszy TAM-KMDAKT może być spowodowana dysfunkcją narządu dystalnego (płuca, serce, mózg), a nie tylko zmianami BUN/Cr.
Rolę kanalikowej mitochondrialnej AKT1 oceniano również u samic myszy KMDAKT. BUN/Cr w surowicy i histologia nerek były stosunkowo wyższe u samic myszy TAM-KMDAKT 45 dni po IRI. Nie zaobserwowano istotnego wpływu na płeć.
Cistanche ziołowe
BIBLIOGRAFIA
1. Yang JY, Deng W, Chen Y i in. Upośledzona translokacja i aktywacja mitochondrialnego Akt1 łagodzi mitochondrialną fosforylację oksydacyjną Aktywność kompleksu V w cukrzycowym mięśniu sercowym. J Mol Cell Cardiol. 2013;59:167–175.
2. Wang Z, Ying Z, Bosy-Westphal A i in. Specyficzne tempo metabolizmu głównych narządów i tkanek w wieku dorosłym: ocena za pomocą mechanistycznego modelu spoczynkowego wydatku energetycznego. Am J Clin Nutr. 2010;92(6):1369–77.
3. Li SY, Susztak K. Rola koaktywatora receptora gamma 1alfa aktywowanego przez proliferatory peroksysomów (PGC{3}}alfa) w chorobie nerek. Semin Nephrol. 2018;38(2):121–6.
4. Portilla D, Dai G, McClure T i in. Zmiany PPARalpha i jego koaktywatora PGC -1 w ostrej niewydolności nerek wywołanej cisplatyną. Nerki Int. 2002;62(4):1208–18.
5. Forbes JM. Odtwarzacze mocy mitochondriów w funkcji nerek? Trendy Metab endokrynolu. 2016;27(7):441–4425.
6. Szeto HH, Liu S, Soong Y i in. Poprawa bioenergetyki mitochondriów w warunkach niedokrwienia zwiększa tolerancję ciepłego niedokrwienia w nerkach. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308(1):F11–F21.6.
7. Kalogeris T, Baines CP, Krenz M, et al. Biologia komórki uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego. Int Rev Cell Mol Biol. 2012;298:229–317.
8. Gracia-Sancho J, Casillas-Ramirez A, Peralta C. Ścieżki molekularne w ochronie wątroby przed uszkodzeniem niedokrwiennym/reperfuzyjnym: aktualizacja z 2015 r. Clin Sci (Londyn). 2015;129(4):345–62.
9. Patrz EJ, Jayasinghe K, Glassford N i in. Długoterminowe ryzyko wystąpienia działań niepożądanych po ostrym uszkodzeniu nerek: systematyczny przegląd i metaanaliza badań kohortowych z wykorzystaniem konsensusowych definicji narażenia. Nerki Int. 2019;95(1):160–72.
10. Szeto HH, Liu S, Soong Y i in. Ochrona mitochondriów po ostrym niedokrwieniu zapobiega przedłużonej regulacji w górę IL-1beta i IL-18 oraz zatrzymuje CKD. J Am Soc Nephrol. 2017;28(5):1437–49.
11. Tran MT, Zsengeller ZK, Berg AH i in. PGC1alpha napędza biosyntezę NAD, łącząc metabolizm oksydacyjny z ochroną nerek. Natura. 2016;531(7595):528–32.
12. Tait SW, zielony DR. Mitochondria i sygnalizacja komórkowa. J Cell Sci. 2012; 125 (cz. 4): 807–815.
13. Deng W, Leu HB, Chen Y i in. Kinaza białkowa B (PKB/AKT1) tworzyła kompleksy sygnałowe z białkami mitochondrialnymi i zapobiegała dysfunkcji energii glikolitycznej w hodowanych kardiomiocytach podczas uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego. Endokrynologia. 2014;155(5):1618–28.
14. Kanegae Y, Lee G, Sato Y i in. Skuteczna aktywacja genów w komórkach ssaków przy użyciu rekombinowanego adenowirusa, w którym zachodzi ekspresja specyficznej dla miejsca rekombinazy Cre. Kwasy nukleinowe Res. 1995;23(19):3816–21.
15. Matsuda T, Cepko CL. Kontrolowana ekspresja transgenów wprowadzonych przez elektroporację in vivo. Proc Natl Acad Sci US A. 2007 1 16;104(3):1027–32.
16. Lee SA, Cozzi M, Bush EL i in. Dysfunkcja narządów odległych w ostrym uszkodzeniu nerek: przegląd. Am J Choroba nerek. 2018;72(6):846–856.
Hugo YH Lin1,2,3,4, Pyszny Chen1, Yu-Han Chen1, Albert P. Ta1,2, Hsiao-Chen Lee1,5, Grant R. MacGregor6, Nosratola D. Vaziri1,2, Ping H. Wang1,2,7
1. UC Irvine Diabetes Center and Department of Medicine, University of California, Irvine, Kalifornia
2. Wydział Fizjologii i Biofizyki Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine w Kalifornii
3. Wydział Lekarski Uniwersytetu Medycznego w Kaohsiung, Kaohsiung, Tajwan
4. Oddział Chorób Wewnętrznych Szpitala Miejskiego Ta-Tung w Kaohsiung, Tajwan
5. Klinika Chirurgii Plastycznej Uniwersytetu Medycznego w Kaohsiung, Kaohsiung, Tajwan
6. Wydział Biologii Rozwoju i Komórki, Uniwersytet Kalifornijski, Irvine, Kalifornia
7. Oddział Cukrzycy, Endokrynologii i Metabolizmu, City of Hope National Medical Center, Duarte, Kalifornia
