Going Micro w chorobie nerek związanej z leptospirozą Ⅱ

4. Odpowiedzi odpornościowe żywiciela na Leptospira spp.

Główną drogą Leptospira jest bezpośrednie przenikanie przez błony śluzowe lub otwartą skórę przez krew, tkanki, mocz lub zanieczyszczoną wodę, co rozprzestrzenia się w krążeniu ogólnoustrojowym i rozsiewa do kilku narządów, takich jakwątroba, płuco i kanalik bliższynefron w nerkach, gdzie może się rozmnażać i przetrwać miesiąc [51]. W początkowej fazie infekcji,wrodzona odpowiedź immunologicznaodgrywa zasadniczą rolę jako pierwsza linia obrony w leptospirozie, wpływając na odpowiedźreceptory rozpoznawania wzorców, fagocytoza makrofagów, indukcja zewnątrzkomórkowanagromadzenie neutrofili, Iinterwencja układu dopełniacza [52].

Theodpowiedź immunologicznau ludzi odgrywa zasadniczą rolę wrozwój objawów klinicznych, podobnie jak czynniki zjadliwości niektórych szczepów chorobotwórczych. Większość leptospirozy u ludzi przebiega bezobjawowo lub jest łagodna, a tylko u 10% przypadków rozwija się ciężka postać z niewydolnością wielonarządową i zwiększoną śmiertelnością związaną zburza cytokinoraz stan immunologiczny. Gatunki patogenne stymulują odpowiedź humoralną w fazie bakteriemii, chociaż późniejsze zachowanieodpowiedź immunologicznajest niejasne. W badaniach pacjentów z wieloma objawami klinicznymi leptospirozy ciężkość obrazu klinicznego powiązano z różnymi poziomami cytokin w surowicy, takich jak TNF-, IL-10 i IL-6 [53], ale wniosek ten pozostaje kontrowersyjny [54]. Schorzenia te doprowadziły do ​​zwiększonego zainteresowania zrozumieniem ogólnej odpowiedzi immunologicznej i zdarzeń biologicznych zachodzących podczas infekcji.

JAK DŁUGO DZIAŁA CISTANCHE?

4.1. Leptospira i układ dopełniacza

Aktywność proteolityczna proteaz Leptospiralnych wobec macierzy zewnątrzkomórkowej umożliwia przedostanie się infekcji do strumienia krążeniowego. Układ dopełniacza w układzie krążenia jest jednym z głównych mechanizmów wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na chorobotwórczą Leptospira. Jednakże Leptospira opracowała strategie ucieczki przed atakiem układu dopełniacza poprzez wiązanie białek w cząsteczki dopełniacza i wytwarzanie proteaz, takich jak termolizyna, termostabilny, obojętny enzym metaloproteinaza, który wpływa na łańcuch białka C3. Szczepy chorobotwórcze wiążą czynnik H (FH), białko 1 związane z czynnikiem dopełniacza H (FHR-1), białko podobne do czynnika H 1 (FHL-1) i białko wiążące C4b (C4BP), wszystkie z nich odpowiadają za hamowanie układu dopełniacza [55]. Istnieją trzy główne strategie unikania dopełniacza przez patogenną Leptospira [55,56] poprzez interferencję regulatorów dopełniacza gospodarza, proteazy gospodarza i proteazy bakteryjnej. W przypadku regulatorów dopełniacza Leptospira wykorzystuje czynnik H (FH; regulator alternatywnego szlaku dopełniacza) i białko wiążące C4 (C4BP; regulator szlaków dopełniacza klasycznego i lektynowego) w celu przyspieszenia rozpadu konwertaz C3, a także działa jako kofaktory czynnika I dla rozszczepienia C3b i C4b [57,58]. Białko leptospiralne (LcpA) wraz z witronektyną (Vn; regulator szlaku końcowego) wiąże C9 i hamuje jego polimeryzację [59], potencjalnie blokując w ten sposób tworzenie kompleksu aktywującego błonę (MAC) [60]. Dodatkowo patogenna Leptospira wiąże kilka proteaz gospodarza, takich jak aktywator plazminogenu typu Urokinazy (uPA), które indukują aktywną plazminę [61] (proteazę serynową) do trawienia C3b, C4b i C5 na powierzchni Leptospira [62]. Co więcej, metaloproteazy i termolizyna, endogenna proteaza Leptospira, mogą rozszczepiać i inaktywować kilka białek dopełniacza (C2, C3, C4 i czynnik B) [60]. Połączenie regulatorów dopełniacza, pochodzących z żywiciela i patogennej Leptospira, ułatwia kolonizację bakterii w docelowych narządach żywiciela [63].

4.2. Leptospira i neutrofile

Podczas infekcji patogenny gatunek Leptospira wywołuje silną aktywację neutrofili i reakcję prozapalną. Neutrofile odgrywają ważną rolę w zwalczaniu mikroorganizmów, ale przyczyniają się również do uszkodzenia tkanek żywiciela. Wykazano, że niski poziom pozakomórkowej akumulacji neutrofili w wyniku niskiej aktywności neutrofilów w krążeniu zwiększa leptospiremię, co wskazuje, że wewnątrznaczyniowe tworzenie rekrutacji neutrofili może mieć kluczowe znaczenie w zapobieganiu wczesnemu rozprzestrzenianiu się patogennej Leptospira [64].

4.3. Leptospira i makrofagi

W początkowej fazie zakażenia Leptospira makrofagi odgrywają ważną rolę w eliminacji krętka. Ten mechanizm efektorowy wraz ze skuteczną odpowiedzią cytokin jest powiązany z kontrolą fagocytów i rozprzestrzenianiem się infekcji, chociaż Leptospira spp. wykazano, że indukuje apoptozę w makrofagach poprzez szlak Fas/FasL-kaspazy-8/-3 i ułatwia ich przeżycie i proliferację w gospodarzu ze względu na uwalnianie czynnika mitochondrialnego indukującego apoptozę i endonukleazę w zakażonych makrofagi [65]. Niedawno przeprowadzono badania nad mikrotranskryptomem makrofagów zakażonych Leptospira w celu określenia mechanizmów epigenetycznych, takich jak regulacja potranskrypcyjna przez RNA. Makrofagi zakażone Leptospira wykazały, że mikroRNA (miRNA) są regulowane przez zakażenie krętkiem, co pokazuje, że ta regulacja jest niezwykle ważna w odpowiedzi komórek układu odpornościowego na zakażenie Leptospira [66]. W ludzkich makrofagach aktywacja stanu zapalnego, w którym pośredniczą reaktywne formy tlenu i lizosomalna katepsyna B, wytwarzana przez zakażenie Leptospira, powoduje znaczny poziom NLRP3 i IL-18, co sprzyja wytwarzaniu IL-1 i prowadzi do wysokiego możliwość fagocytozy i szybkie modelowanie niektórych cytokin koreluje z opornością na leptospirozę [67].

4.4. Humoralna odpowiedź na Leptospira

Specyficzna odpowiedź humoralna przeciwko Leptospira charakteryzuje się wytwarzaniem przeciwciał IgM i IgG w trzecim dniu wystąpienia objawów. Ponadto zgłaszano wytwarzanie IgA od pierwszego do dziewiątego miesiąca po zakażeniu; w rzeczywistości wzrost poziomu IgM stosowano jako alternatywną miarę we wczesnej diagnostyce leptospirozy [68]. Wpływ odpowiedzi humoralnej u ludzi chorych na leptospirozę pozwala na postawienie diagnozy serologicznej po naturalnym zakażeniu [69]. Najważniejszym aspektem odpowiedzi humoralnej w zakażeniu Leptospira może być tworzenie przeciwciał ochronnych. Obecnie dostępne szczepionki przeciwko leptospirozie składają się z kompletnych preparatów komórkowych i mają ograniczenia, takie jak niska skuteczność, liczne skutki uboczne, niskie wytwarzanie pamięci immunologicznej i brak ochrony krzyżowej w przypadku różnic serotypowych. W związku z tym konieczne jest opracowanie nowych szczepionek w celu zwalczania chorób, a obecnie prowadzone są badania nad produkcją szczepionek na bazie immunizacji genetycznej [70]. OMP Leptospira uznano za antygen o lepszej immunogenności dla limfocytów B, do których należą epitopy strukturalne OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ {9}} i LipL41263-282 [71]. Epitopy te są obiecującymi kandydatami do opracowania uniwersalnej szczepionki.

4,5. Adaptacyjna odpowiedź immunologiczna na Leptospira: komórki T i cytokiny

Patogenne gatunki Leptospira indukują odpowiedź immunologiczną, w której pośredniczą limfocyty T i B, której towarzyszy ekspresja cytokin, co można powiązać z wykresami grawitacyjnymi. Aktywacja limfocytów T podczas zakażenia Leptospira inicjuje odpowiedź zapalną, głównie poprzez produkcję cytokin. Ma to kluczowe znaczenie we wczesnej eliminacji infekcji, ale niekontrolowana produkcja cytokin prozapalnych może również skutkować nadprodukcją cytokin, po której następuje stan paraliżu immunologicznego, który może prowadzić do posocznicy i niewydolności wielonarządowej. Limfocyty T wytwarzają IL-1, IL-6, IL-12, interferon (IFN)- i TNF-, które działają jako chemoatraktanty, rekrutując leukocyty w miejscu zakażenia. Co ciekawe, in ex vivo naiwne limfocyty T δ proliferowały w hodowlach jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) stymulowanych antygenami Leptospiry, wytwarzając zarówno IL-17, jak i IFN [72]. Co więcej, podczas gdy myszy typu dzikiego zakażone leptospirozą wykazywały wyższy poziom wielu cytokin, w tym IL-4, IL-10 i IL-13 w porównaniu z myszami niezakażonymi, mysie przewlekłe wywołane Leptospira zapalenie nerek (myszy Daf1-/-) wykazywało wyższą ekspresję aktyny mięśni gładkich, IL-10, IL-13, ale nie było różnicy między IL-12 i IL{{21} } poziomów [73]. Jako takie, Daf1 i IL-17 mogą odgrywać kluczową rolę ochronną w postępie PChN jako związek między mysią PChN wywołaną Leptospira a zwłóknieniem nerek [72,73]. Jednakże hipoteza dotycząca odpowiedzi wybranych cytokin na progresję choroby w przypadku leptospirozy u ludzi jest nadal niejednoznaczna. U pacjentów z ciężką leptospirozą i zajęciem płuc uzyskano podwyższone poziomy IL-6, CXCL8 i IL-10 w porównaniu z pacjentami z łagodną leptospirozą [53]. Te wysokie stężenia cytokin u pacjentów z leptospirozą podkreślają ich kluczową rolę w rozwoju ciężkiej leptospirozy.

U pacjentów z ciężką infekcją stwierdza się limfocyty T CD4+ o profilu prozapalnym oraz producentów IL-2 i IFN-, natomiast CD4+ CD25 o wysokim poziomie producentów IL-10 są prawie nieobecni. Nie wydaje się, aby regulacja odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem limfocytów T zapobiegała uszkodzeniom tkanek powodowanym przez odpowiedź zapalną na Leptospira. W limfocytach T CD4+ ludzi chorych na ciężką leptospirozę wytwarzanie TNF- i innych cytokin prozapalnych jest wyższe niż u limfocytów z łagodną postacią choroby, co wskazuje, że cytokiny te można wykorzystać jako markery nasilenie w fazie immunologicznej infekcji [74]. Wytwarzanie IL-10 powiązano z ryzykiem śmierci u ludzi chorych na leptospirozę; jednakże badanie przeprowadzone na ludziach narażonych na działanie wirusa i bez objawów powiązało wytwarzanie tej cytokiny z kontrolą odpowiedzi zapalnej i przeżyciem [74]. Podczas zakażenia Leptospira mediatory stanu zapalnego i działanie niektórych komórek leukocytów, takich jak limfocyty T, u osób opornych ulegają szybkiej regulacji, w przeciwieństwie do osób z ciężkimi postaciami leptospirozy [75].

Podsumowując, odpowiedź immunologiczna na infekcję Leptospira nie jest w pełni poznana ze względu na zachowania kliniczne pacjentów chorych na leptospirozę, którzy wchodzą w interakcję z różnymi czynnikami zjadliwości genomu bakterii, co nadaje Leptospirowi solidną zdolność patogenetyczną.

5. Objawy kliniczne

Objawy kliniczne leptospirozy są różnorodne i obejmują łagodne, niespecyficzne objawy, takie jak objawy grypopodobne (gorączka, bóle mięśni i ból głowy), aż do ciężkich objawów ze schyłkowym uszkodzeniem narządów (np. AKI, ostra niewydolność wątroby). i skaza krwotoczna, znana również jako zespół Weila), ostre krwioplucie w wyniku krwotoku płucnego, ostre splątanie w wyniku aseptycznego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu oraz ostra niewydolność serca w wyniku ostrego lub podostrego zapalenia mięśnia sercowego [7]. W związku z tym trzy wskaźniki podejrzenia zakażenia leptospirozą obejmują (i)ostra choroba przebiegająca z gorączką, (ii) żółtaczka oraz (iii)ostre uszkodzenie nerek[12]. Do czynników predykcyjnych ciężkiej postaci leptospirozy zalicza się silny ból mięśni na początku, silną skłonność do krwawień i wyraźną żółtaczkę. Co ciekawe, obecność obu istniejących wcześniejprzewlekłą chorobę nerek(mały rozmiar nerek) lub powiększone, przekrwione nerki z bezmoczem wiążą się z najgorszym rokowaniem [12]. Dlatego też pacjentów z chorobą nerek związaną z leptospirozą należy natychmiast leczyć.

6. Diagnoza

6.1. Diagnoza kliniczna

Rozpoznanie leptospirozy opiera się na historii narażenia, czynnikach ryzyka i objawach klinicznych. Wysoki wskaźnik podejrzeń może zapobiec późniejszemu uszkodzeniu narządów. Jednak objawy leptospirozy są często mylone z innymi przyczynami ostrego zespołu gorączkowego, takimi jak zakażenie dengą, malaria, zapalenie wątroby i aktywna choroba autoimmunologiczna. Brak patognomonicznych cech leptospirozy powoduje, że rozpoznanie wstępnie opiera się na ocenie gorączki i bólów mięśni u pacjentów z obszaru endemicznego. Z tego powodu niezbędna jest diagnostyka laboratoryjna leptospirozy.

6.2. Diagnostyka laboratoryjna

Leptospiroza jest trudna do zdiagnozowania w laboratorium, zwłaszcza w ostrej fazie. Można to przeprowadzić poprzez bezpośrednią identyfikację krętków lub ich składników w płynach ustrojowych lub tkankach, izolację leptospir w hodowli lub wykrywanie określonych przeciwciał w różnych fazach klinicznych. Leptospirozę trudno odróżnić od chorób takich jak malaria, gorączka denga, riketsja, grypa, zapalenie wątroby i żółta febra ze względu na jej niejasny obraz kliniczny. W rezultacie potrzebne są badania laboratoryjne w celu potwierdzenia diagnozy. Podstawą tych testów (DNA) jest wykrycie przeciwciał przeciwko leptospirom, samym leptospirom lub ich kwasowi dezoksyrybonukleinowemu. Aktualna diagnostyka laboratoryjna obejmuje zarówno identyfikację bezpośrednią (wykrywanie krętków lub DNA Leptospira w próbkach lub izolację organizmu z próbek), jak i wykrywanie pośrednie (diagnostyka serologiczna lub serologia w celu identyfikacji zakażenia Leptospira, która opiera się na wykryciu specyficznych przeciwciał przeciwko różnym Antygeny leptospiralne) (Tabela 1).

6.2.1. Bezpośrednie badanie mikroskopowe, hodowla i wykrywanie antygenu

Leptospiry to cienkie, jasne, aktywnie poruszające się spirale o charakterystycznie szybkim wirowaniu (ruch drgawkowy) pod konwencjonalnym mikroskopem ciemnego pola (DFM), a do wykrycia jednej komórki w polu potrzeba około 10 leptospirów/ml. Przy tygodniowym dłuższym czasie trwania infekcji, plon DFM wynosi około 10% (od 100 do 90%). Aby zwiększyć czułość, kilka specjalnych metod barwienia; Warthin – barwienie srebrem gwiaździstym [76] i barwienie immunologiczne (immunohistochemia, immunofluorescencja, immunomagnetyczny wychwyt antygenu i barwienie immunoperoksydazą [77]), które wymagają przeciwciał pierwotnych specyficznych dla serowaru (w izolacji lub kombinacji).

Tabela 1. Badania laboratoryjne w diagnostyce leptospirozy.

LAMP, wzmocnienie izotermiczne za pośrednictwem pętli; PCR, reakcja łańcuchowa polimerazy; NGS, sekwencjonowanie nowej generacji; IHA, hemaglutynacja pośrednia; ELISA, test immunoenzymatyczny; IgM, immunoglobulina M; MAT, makroskopowy test aglutynacji; MCAT, test aglutynacji mikrokapsułek; DNA, kwas dezoksyrybonukleinowy; DFM, mikroskopia w ciemnym polu

Równolegle możliwa jest hodowla Leptospira z krwi, moczu, płynu mózgowo-rdzeniowego i tkanki biopsyjnej w ciągu pierwszych kilku dni do 10 dni po wystąpieniu objawów choroby (stadium leptospirozy). Ponieważ rosną powoli (czas podwajania 6–8 h), są wymagające i podatne na zanieczyszczenia, próbki hodowli należy przechowywać przez co najmniej 3–4 miesiące przed wyrzuceniem jako ujemne) z czułością tylko 23%, ale jest to konieczne do testu wrażliwości na leki [6]. Jako takie, podłoże EMJH (Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris) (kompleks albumin oleinowych) składa się z albuminy surowicy bydlęcej (frakcja V), Tween 80, chlorku amonu, tiaminy, fosforanu monopotasu, fosforanu disodu i różnych składników odżywczych [78]. powszechnie stosowane, podczas gdy w przypadku niektórych serotypów wymagane są bardziej wyspecjalizowane podłoża T80/40/LH (polisorbat 40, hydrolizat laktoalbuminy, dysmutaza ponadtlenkowa i surowica królicza) [79]. Do pierwotnej izolacji szerokiego i różnorodnego zakresu wymagających patogennych leptospir, dobrą pożywką wydaje się Hornsby-Alt-Nally (HAN) [80].

Wykrywanie antygenów Leptospira za pomocą immunoperoksydazy, immunofluorescencji lub immunomagnetycznego systemu wychwytywania antygenu opracowano dla próbek o niskim obciążeniu bakteryjnym lub nie można zastosować mikroskopii w ciemnym polu, ale nie jest ona rutynowo wykonywana ze względu na ograniczenia dotyczące przeciwciał pierwotnych [77]. Natomiast rozpoznawanie kwasów nukleinowych za pomocą nowej amplifikacji DNA; reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) (tj. zagnieżdżona PCR, ilościowa PCR [qPCR]), amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) i sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) są cenne dla wczesnej i dokładnej diagnostyki laboratoryjnej, zwłaszcza w przypadku Izolacja Leptospira z wykorzystaniem inokulacji pożywek biologicznych i hybrydyzacji DNA (sonda DNA) [81,82]. Do celów diagnozy można amplifikować różne cele leptospiralne (takie jak rybosomalny RNA 16S) lub DNA [83], a PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR) jest bardziej czuły i swoisty niż standardowa PCR [84]. Ponieważ niektóre startery RT-PCR mogą wiązać się z niespecyficznym miejscem, co prowadzi do fałszywie dodatnich wyników, najnowsze testy multipleksowej PCR w czasie rzeczywistym opracowano przy użyciu dwóch zestawów starterów [85]. Nested PCR pomaga również w wykrywaniu bardziej specyficznych i wrażliwych miejsc DNA za pomocą dodatkowych zestawów starterów [86,87). Jednak obecne trendy w diagnostyce leptospirozy obejmują stosowanie zarówno technik serologicznych, jak i molekularnych, takich jak PCR i ELISA (łatwiejszy niż złoty standard serologiczny MAT), w krajach o ograniczonych zasobach [88,89]. Ponadto technika LAMP [90] służąca do wykrywania genu 16S rRNA (rrs) jest opłacalną, szybką i wydajną metodą wykrywania patogennych leptospir w moczu. Obecnie NGS jest najdokładniej opartą, niezależną od kultury metodą analizy genomu rdzeniowego w płynach ustrojowych (krew i mocz) [91], a przyszłym kierunkiem testów na leptospirozę byłoby przejście w stronę molekularnej klasyfikacji leptospir, co pokonuje ograniczenia izolacja kulturowa leptospir z próbek klinicznych. Dlatego też wartość PCR w diagnostyce klinicznej leptospirozy jest szczególnie duża i pojawia się kilka nowoczesnych technik

6.2.2. Wykrywanie przeciwciał przeciw Leptospira

Stosuje się kilka diagnoz serologicznych; na przykład testy przeciwciał specyficznych dla rodzaju (hemaglutynacja pośrednia [IHA], test immunoenzymatyczny [ELISA], Lepto Dri Dot [aglutynacja lateksowa], aglutynacja mikrokapsułek [MCAT]) i testy przeciwciał swoistych dla serotypów (mikroskopowy test aglutynacji [ MAT]) [92,93]. W związku z tym kryteriami MAT do rozpoznania są (i) czterokrotny wzrost miana w sparowanych surowicach (serokonwersja aktualnej infekcji) lub (ii) pojedyncze wysokie miano (większe lub równe 1:400 lub 1:800, wyższe w przypadku epidemii obszarach) (seropozytywność) (przeciwciała mogą utrzymywać się przez pewien czas po zakażeniu lub reagować krzyżowo z innymi chorobami). Dodatkowo MAT wymaga żywego panelu wszystkich serotypów Leptospira w regionie, z panelem lokalnie standaryzowanych serotypów [93,94] zgodnie ze Światową Organizacją Zdrowia Zwierząt (19 antygenów reprezentatywnych dla 15 serogrup) [95]. Ponieważ przeciwciała są wykrywalne 5–7 dni po zakażeniu, test MAT może dać wynik ujemny (miano < 1:50) w ciągu pierwszych kilku dni zakażenia. Rozpoznanie leptospirozy można przeprowadzić na podstawie próbek moczu [96], wykorzystując zarówno metody serologiczne, jak i wykrywanie molekularne (16S rRNA), szczególnie u pacjentów z niedawną infekcją (MAT większy lub równy 1:800 lub wynik testu ELISA IgM-dodatni lub oba) [97] .

Przy ograniczonych zasobach kliniczna ocena prognostyczna [98] oparta na odpowiedniej historii klinicznej i powiązanych badaniach laboratoryjnych z punktacją w siedmiu aspektach jest następująca: niedociśnienie (3), żółtaczka (2), ból mięśni (2), AKI (1,5) proponuje się niski poziom hemoglobiny (3), hipokaliemię z hiponatremią (3) i neutrofilię (1) (sumaryczny wynik odcięcia wynoszący 4 oznacza pole pod krzywą charakterystyki działania odbiornika {{10}}.78 ( 95% CI 0,68–0,89) dla rozpoznania leptospirozy [77]). Wynik prawdopodobieństwa przyjęcia do szpitala metodą Thai-Lepto może stanowić narzędzie diagnostyczne umożliwiające wczesną przypuszczalną diagnozę leptospirozy u pacjentów z poważnym klinicznym podejrzeniem choroby.